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第三军医大学学报

第三军医大学学报杂志

Journal of third military medical university 제삼군의대학학보

统计源期刊
  • 主管单位: 第三军医大学
  • 主办单位: 第三军医大学
  • 影响因子: 1.01
  • 审稿时间: 1-3个月
  • 国际刊号: 1000-5404
  • 国内刊号: 50-1126/R
  • 发行周期: 半月刊
  • 邮发: 78-91
  • 曾用名:
  • 创刊时间: 1979
  • 语言: 英文
  • 编辑单位: 第三军医大学学报编辑委员会
  • 出版地区: 重庆
  • 主编: 王正国
  • 类 别: 医药卫生综合
期刊荣誉:
  • 左旋精氨酸对未成熟兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

    作者:王学锋;肖颖彬;曾祥君

    目的研究左旋精氨酸(L-ARG)对未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法实验采用幼兔离体心脏灌注模型,实验分为:①对照组:以K-H液(Krebs-Henseleit solution)再灌注;②L-ARG组;K-H液加入L-ARG(1 mmol/L);③N-亚硝基左旋精氨酸(L-NNA)组:加入L-ARG(1 mmol/L)和L-NNA(2 mmol/L).各组均以Thomas2号液为心停搏液,15~20 ℃缺血90 min,再灌注30 min.测定缺血前,再灌注中心功能指标和冠脉流出液中一氧化氮、内皮素含量以及缺血前、再灌注后心肌组织脂质过氧化产物丙二醇含量.结果①对照组和L-NNA组再灌注后一氧化氮含量下降(P<0.05) ,L-ARG组无下降, ②L-ARG组再灌注后心功能恢复优于对照组和L-NNA组(P<0.05).③L-ARG组再灌注后心肌组织丙二醛含量和冠脉流出液中内皮素含量低于对照组和L-NNA组(P<0.05).结论未成熟兔心肌缺血再灌注后一氧化氮合成释放减少,再灌注早期补充左旋精氨酸增加一氧化氮生成量.左旋精氨酸对未成熟心肌缺血再灌注损伤具有良好的保护作用.

  • 生长抑素类似物诱导人胆管癌细胞株凋亡及对胞内游离钙的影响

    作者:陈华;何振平;马宽生;王曙光

    目的探讨生长抑素类似物SMS201-995(SMS)是否通过诱导人胆管癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长,以及与细胞内游离钙的关系.方法采用人胆管癌细胞系SK-ChA-1,应用MMT比色法, Annexin V-FITC技术及激光共聚焦显微镜技术等方法进行检测和观察.结果在SMS作用下SK-ChA-1细胞生长受抑制.SMS处理SK-ChA-1细胞后, Annexin V标记的凋亡细胞增多.细胞凋亡的同时细胞内游离钙浓度升高.结论 SMS可能通过诱导SK-ChA-1细胞[Ca2+]i依赖性细胞凋亡,抑制胆管癌生长.

  • TNF-α和IL-1对大鼠肝细胞糖皮质激素受体表达及功能的影响

    作者:王军平;粟永萍;赵景宏;周艳红;秦荣;刘贤华

    目的研究TNF-α和IL-1对大鼠肝细胞糖皮质激素受体(GR)的表达和转录激活能力的影响,探讨炎性细胞因子诱发糖皮质激素抵抗的内在机制.方法免疫细胞化学染色分析经TNF-α和IL-1刺激培养后BRL-3A大鼠肝细胞株GR的表达和核转位变化,应用糖皮质激素反应元件报告质粒pMAMneo-CAT分析系统观察GR的转录激活能力改变.结果 BRL-3A细胞经TNF-α和IL-1刺激培养12 h后,其胞浆和胞核GR蛋白水平的表达明显降低,尤以核内GR降低更加显著;转染pMAMneo-CAT质粒的肝细胞在地塞米松存在情况下,经TNF-α和IL-1刺激后CAT含量显著下降,两者协同效果更加明显.结论 TNF-α和IL-1可以通过降低BRL-3细胞GR的表达和核转位而抑制GR的转录激活能力,这可能是炎性细胞因子诱发糖皮质激素抵抗的主要机制.

  • CagA 阳性Hp培养滤液诱导转化的胃上皮细胞表达泛素活化酶E1基因

    作者:陈洁平;沈鼎明;杨致邦

    目的研究CagA阳性Hp培养滤液对人胃粘膜上皮细胞(GES-1)作用的机制. 方法将CagA阳性Hp培养滤液诱导恶性转化的GES-1细胞与CagA阴性Hp培养滤液处理的GES-1细胞进行mRNA差异显示,以寻找Hp致胃癌发病的相关基因.结果 mRNA差异显示片断之一命名为PFN1,仅在Hp(CagA+)培养滤液处理的GES-1细胞中表达, 斑点杂交结果与之一致.与Gene Bank资料序列同源性比较分析提示PFN1与泛素活化酶E1同源性99%,即为人类泛素活化酶E1基因的一部分. 结论泛素-蛋白水解酶复合体通路中的泛素活化酶E1基因可能参与了Hp 的CagA诱导的胃上皮细胞恶性转化过程.

  • CTLA4胞外区蛋白在GS115酵母中的表达和活性鉴定

    作者:朱瑾;吴军;易绍萱;陈希炜;郑峻松;罗高兴;张宁

    目的获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白. 方法构建CTLA4胞外区(CTLA4125)蛋白的酵母表达载体,在GS115酵母细胞中表达.通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白,并在CTLL2细胞中鉴定活性.结果质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白.经纯化后的蛋白可抑制IL-2刺激的CTLL2细胞的增殖.结论 GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白.

  • 慢性重型乙型肝炎肝内淋巴细胞AICD现象的探测

    作者:李玲;顾长海;王雅凡

    目的了解肝脏局部浸润淋巴细胞是否存在AICD现象及其意义.方法采用S-P法检测10例慢性重型乙型肝炎肝组织Fas和FasL表达.结果 10例慢性重型乙型肝炎肝内浸润淋巴细胞和肝细胞皆有不同程度的Fas和FasL的表达,Fas和FasL在淋巴细胞和肝细胞皆以膜浆型表达为主.结论慢性重型乙型肝炎肝组织内细胞损伤的效靶关系十分复杂,肝组织浸润淋巴细胞存在激活诱导细胞死亡现象,浸润的淋巴细胞可能通过Fas/FasL介导的凋亡途径而下调免疫反应.

  • TGF-β1对增生性瘢痕成纤维细胞中c-myc和c-fos表达及胶原分泌的影响

    作者:毋巨龙;李荟元;李世荣

    目的了解TGF-β1对增生性瘢痕成纤维细胞中癌基因c-myc和c-fos的表达及胶原分泌的影响,探讨瘢痕增生机制. 方法烧伤患者增生性瘢痕6例标本,通过细胞培养研究了TGF-β1对增生性瘢痕成纤维细胞癌基因c-myc和c-fos的表达(免疫组织化学和图像分析方法)及胶原分泌(3H-脯氨酸法)的影响. 结果 TGF-β1可显著提高增生性瘢痕成纤维细胞癌基因c-myc和c-fos的表达, 图像分析结果面密度(c-myc: 0.0687±0.0072 vs 0.0141±0.0016,P<0.01;c-fos: 0.0529±0.0048 vs 0.0223±0.0021,P<0.01);平均灰度(c-myc: 3340±462 vs 1120±232 ,P<0.01; c-fos: 1402±286 vs 605±79,P<0.01);积分吸光度[c-myc: 2.0±0.3 vs -(1.5±0.2), P<0.01; c-fos: 3.3±0.4 vs -(1.3±0.1), P<0.01]等指标经统计学处理与对照组有显著性差异;TGF-β1可促使增生性瘢痕成纤维细胞合成分泌胶原率提高2.0倍(P<0.01). 结论 TGF-β1可能是通过癌基因c-myc和c-fos的表达而促进增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成分泌增加.

  • 大鼠坐骨神经损伤后再生过程结构形态三维重建研究

    作者:陈菁;楚燕飞;朱刚;李兵仓;吴国萍;黄宏;陈志强

    目的探讨大鼠坐骨神经损伤后再生过程结构形态三维重建的方法, 三维重现再生神经通过损伤界面和吻合口的过程及规律.方法用硅胶管桥接60只大鼠左侧坐骨神经长6 mm缺损,术后3、7、15、30、60、90 d取坐骨神经远近端各1 cm,石蜡包埋,连续切片,HE、硝酸银-luxol快蓝染色,显微摄像输入微机后进行图像配准、二维综合处理,终在SGI 三维图形工作站上完成三维重建和显示.结果三维图像显示新生神经纤维与正常神经纤维相比有郎飞氏结尚未形成、排列紊乱、髓鞘较薄、轴索较细、神经膜管形成等差异,胶原纤维大量增生阻碍了新生神经纤维的生长.结论利用计算机图像重建技术,采用三维图像的形式对外周神经再生过程和再生规律进行可视化研究,是一种有效的方法.

  • 大鼠长骨成骨细胞体外培养形态观察

    作者:王华;黎海芪;杨锡强;瞿平;刘瑜

    目的建立生长期大鼠长骨成骨细胞体外培养实验模型并观察其生长及骨化过程.方法以10周龄Wistar大鼠股骨、胫骨为材料,采用酶分次消化法分离成骨细胞,经DME:F-12加10%胎牛血清的培养基原代和传代培养或含50 μg/ml L-抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的培养基连续培养,追踪观察成骨细胞在体外培养中的增殖及形态变化,并通过Giemsa、ALP及von Kossa染色技术,观察细胞体外基质分泌和骨化过程.结果①大鼠长骨成骨细胞具有体内成骨细胞的形态特征,增殖代谢旺盛,其群体倍增时间为78 h.②成骨细胞分泌形成球形和无定形基质.③当给予钙化条件培养时,细胞形成钙化骨基质.④大多数细胞ALP染色呈阳性并与基质的钙化密切相关.结论培养的生长期大鼠长骨成骨细胞具有成骨细胞的某些生物学行为,为儿童骨生长及调控的研究提供了一种实验模型.

  • 缺血再灌注心肌白介素-1表达和N-乙酰半胱氨酸对损伤影响的观察

    作者:司良毅;陈运贞

    目的探讨白介素-1(IL-1)mRNA及蛋白在缺血心肌的表达规律及与再灌注损伤之间的关系,并观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对缺血组织的影响.方法大鼠116只,随机分设缺血再灌注组(IR组),IR+NAC治疗组和假手术对照组(Sham组);先缺血60 min,然后分设再灌注1、3、6、12、24 h共5个时相点;治疗组于缺血10 min腹腔注射NAC160 mg/kg.于各相应时相点活杀动物取缺血区心肌待测.IL-1 mRNA表达用原位杂交检测,用免疫组织化学法测定其蛋白表达,心肌组织MDA用硫代巴比妥酸比色法测定,心肌组织SOD活性测定用黄嘌呤过氧化物酶法,心肌组织ATP酶活性用磷比色法测定,心肌梗塞范围测定用TTC染色法.结果心肌IR后,IL-1 mRNA及蛋白质表达明显增高,分别于3,6 h达高峰,心肌MDA含量明显增高而SOD、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性明显降低,心肌梗塞范围于24 h内呈逐步增加趋势;IL-1表达水平与心肌梗塞范围变化之间无明显相关性,但与MDA之间呈明显正相关,与SOD、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase之间呈明显负相关;NAC可使上述生化指标的变化明显改善,心肌梗塞范围缩小.结论缺血再灌注过程中心肌IL-1表达水平明显增加,NAC可抑制IL-1 mRNA及蛋白表达水平并使心肌梗死范围缩小.

  • 分段式筋膜内全子宫切除术216例分析

    作者:杨鹰;李幼飞

    全子宫切除术是妇产科常见手术之一,针对该手术难点集中在对盆腔深部的子宫血管及宫颈的处理这一问题,我们设计了分段式筋膜内全子宫切除术,共施行216例,与同期传统术式相对照[1],效果满意,现报道如下.

  • 60例结石性胆囊炎伴细菌性肝损害患者的外科治疗体会

    作者:钟彦文;郭渝明;聂伟

    我院自1998年8月至2001年8月共收治60例伴有ALT、GGT升高的结石性胆囊炎病人,其中34例两酶同时升高.现就ALT、GGT升高的原因及手术治疗指征分析讨论如下.

  • 犬大腿内侧游离皮瓣的切取

    作者:孙远;李慧增;史文进;容国俊

    目的提供一种用于动物实验研究的游离皮瓣切取方法.方法于犬大腿内侧隐动、静脉走行区域设计,在内侧肌群肌膜表面切取带血管蒂皮瓣,保留隐神经.结果皮瓣平均面积为3.2 cm×3.0 cm.隐动脉直径为1.1 cm,股静脉直径为3.0 cm,血管蒂长度3.5~4.0 cm.结论带血管蒂的犬大腿内侧皮瓣为游离皮瓣修复组织缺损的研究提供了良好方法.

  • 大鼠脑组织中兴奋性氨基酸的快速检测

    作者:孙玮;潘峰;张正治

    目的建立一种快速、准确的脑内兴奋性氨基酸定量检测方法.方法采用6300黄金系统氨基酸分析仪,在锂柱130 min程序生理体液分析方法基础上,根据兴奋性氨基酸(EAAs)的特性,建立了EAAs的快速测定方法.结果此方法完成兴奋性氨基酸分析的时间是20 min,比原方法缩短了110 min;且有较好的重现性(Glu CV:日内1.86%,日间2.32% ;Asp CV:日内1.42%,日间2.48%)和回收率(Glu 97.7%;Asp 97.3%).并用此方法观察了高原低氧大鼠下丘脑EAAs的含量变化.结论本方法定量检测兴奋性氨基酸快速、准确,并利于大批量样品的快速测定.

  • 以临床应用为目标加强软骨与骨组织工程基本问题研究

    作者:李起鸿

    组织工程学近年来有很大的进展.目前,应用组织工程技术已成功地培育出人耳廓、人工肌腱及具有人指(趾)骨及指(趾)间关节结构与外形的复合组织等,为组织工程化产品的临床应用展示了良好的前景[1,2].组织工程学的研究主要包括种子细胞、支架材料、细胞-支架复合体体外构建与培育三个方面.种子细胞研究涉及来源的选择、体外大量扩增、表型诱导与维持及移植免疫等.支架材料研究则是根据不同组织和器官组织工程制备技术的需要,进行其三维支架的制备工艺设计及结构与性能优化.细胞-支架复合体体外构建与培育是组织工程研究的核心内容,包括接种细胞浓度与工程化组织产量的关系,种植细胞在支架材料中粘附、增殖、代谢的定性与定量研究,以及模拟体内细胞生长所处的微环境及动力学特征的生物反应器等研究[3,4].

    关键词: 组织工程 软骨与骨
  • 组织工程化关节软骨细胞凋亡的研究

    作者:谢肇;许建中;周强;解世杰

    目的观察离心管构建的组织工程软骨细胞凋亡及细胞增殖情况.方法对离心管构建3周的组织工程软骨进行透射电镜、流式细胞仪检测和3H-TdR掺入测定,与3周龄兔关节软骨对照.结果透射电镜检查组织工程软骨有5%左右的细胞凋亡,正常关节软骨未见明显的细胞凋亡;流式细胞仪显示软骨细胞有8.5%左右的亚二倍体细胞,正常关节软骨有2.4%左右的亚二倍体细胞.3H-TdR掺入测定显示细胞增殖能力较正常关节软骨明显增强.结论培养3周的组织工程软骨细胞凋亡与细胞增殖均较正常软骨增强.

  • 组织工程法修复兔肌腱缺损

    作者:何清义;李起鸿;许建中;杨柳

    目的应用组织工程的原则,种植成纤维细胞于人羊膜细胞外基质(HA-ECM)以修复兔的肌腱缺损.方法从胎兔分离的成纤维细胞用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后种植于人羊膜细胞外基质上.以1 cm长的兔跟腱缺损为修复对象,用聚酯聚二氧杂环己烷缝线(PDS)轴心桥接肌腱缺损,外包种植有成纤维细胞的HA*ECM膜.术后进行功能锻炼.结果成纤维细胞在HA*ECM上生长良好,放射状或平行排列.成纤维细胞-HA-ECM组能够修复肌腱缺损并且腱化的速度和质量明显优于仅用PDS和HA-ECM(无成纤维细胞)修复组,与正常肌腱相似,抗张强度达正常腱的81.8%.BrdU 免疫组化显示成纤维细胞在腱化过程中起了重要的作用.术后的功能锻炼促进了修复腱的腱化及抗张强度的提高.结论成纤维细胞-HA*ECM膜能够有效修复肌腱缺损,可作为肌腱修复的另一种选择方法.

  • 兔骨髓基质细胞在诱导条件下的成骨特性

    作者:顾祖超;李起鸿;赵玉峰;周红星

    目的观察兔骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力.方法使用密度梯度离心分离兔骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况.结果骨髓基质细胞呈成纤维细胞样表现,增殖能力强.诱导条件下第2代细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,10~12 d达到高峰,并且出现矿化结节.结论使用本实验方法,获得的骨髓基质细胞成骨能力肯定,增殖能力强,可作为骨组织工程的种子细胞.

  • 生长因子(IGF-I、TGF-β1和BMP-2)对兔关节软骨细胞体外增殖的作用

    作者:许建中;解志杰;杨物鹏;兰旭

    目的观察IGF-Ⅰ、TGF-β1和BMP-2对培养兔关节软骨细胞增殖的作用.方法采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,利用3H-TdR掺入反映软骨细胞增殖.结果 IGF-Ⅰ和TGF-β1均可促进软骨细胞3H-TdR掺入增加,并有一定的协同作用.而BMP-2对软骨细胞3H-TdR掺入无显著影响,但与TGF-β1和IGF-Ⅰ合用时却有抑制3H-TdR掺入的作用.结论生长因子之间的不同组合可以协同或拮抗方式影响软骨细胞的增殖,提示生长因子在关节软骨退变和防治上可能有重要的意义.

  • 人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化

    作者:杨柳;段小军;戴刚;唐康来;谭祖键;周强;李起鸿

    目的确定人间充质干细胞(MSCS)体外扩增培养、向成骨细胞表型转化的方法,了解其生物学特性变化.方法分离人骨髓细胞,按不同种植密度、首次换液时间进行原代培养,对传代培养细胞用化学药物或生长因子进行成骨诱导培养,并检测成骨细胞表型、生长曲线、贴壁率.结果人MSCS原代培养种植细胞密度为1×105~3×105/cm2,48 h后半量换液,以后每3 d全量换液的方法较合理.经化学药物(如地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C)或生长因子(rh-BMP2、BMPS)作用后,MSCS表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和骨钙素,细胞增殖速度减慢,贴壁率略降低.未诱导MSCS形成细胞团后,可自动分化表达碱性磷酸酶活性.结论合理的人MSCS培养方法及可靠的诱导条件,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞.

  • 新型组织工程化人工骨的体外初步构建

    作者:段小军;杨柳;石宗利;周强

    目的应用组织工程学技术,体外初步构建有活性的人工骨.方法培养、诱导人间充质干细胞向成骨细胞表型转化,制备性能优越的支架材料,将细胞与材料复合构建人工骨,在体外培养一定时间后,扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构和消化细胞行碱性磷酸酶染色.结果 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原按一定的方法可构建出新型的骨组织工程复合支架材料,诱导后的间充质干细胞可在材料内良好贴附生长,维持成骨细胞表型.结论本实验为骨组织工程学的进一步研究与应用提供了新的材料和方法.

  • 新型骨与软骨组织工程支架材料制备及其性能研究

    作者:戴刚;石宗利;李起鸿;李重庵

    目的研制符合骨与软骨组织工程制备技术要求的新型支架复合材料;并确定其性能与结构优化设计的主要参数指标.方法按不同CPPf(聚磷酸钙纤维)/PLLA(L-聚乳酸)重量比及相同CPPf+PLLA/NaCl 颗粒重量比,采用溶铸颗粒沥取(Solvent-casting particulte-leaching)法制备系列CPPf/PLLA支架复合材料;液体置换法、压缩性能测试及扫描电子显微镜观测其密度、孔隙度、压缩模量及微结构特征;材料样品体外人工降解液直接浸渍法判定其生物降解性能,并观测其生物降解率、压缩模量及微结构改变.结果系列支架材料密度为0.108~0.165 g/cm3,孔隙度87.17%~93.24%,压缩模量为5.19~7.89 MP,横截面微结构由微孔海绵状过渡为纤维网状.随着支架材料在人工降解液中降解时间的延长,其降解率以0%~13.2%线性递增;压缩模量呈线性降低至1.10~2.78 MP;材料横截面微结构则发生相应改变. 结论 CPPf/PLLA支架复合材料具有高孔隙度的三维立体结构,良好的抗压缩性能和生物降解性能,经进一步优化设计后,可成为结构和性能符合各项要求的新型骨与软骨组织工程支架材料.

  • TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用及BMP蛋白表达影响的研究

    作者:唐康来;杨柳;许建中;卢卫忠;吴梅英;李起鸿

    目的探讨TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用及BMP蛋白表达的影响.方法采用ALP活性测定及骨结节计数方法观察TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外的成骨作用,BMP-McAb免疫组化染色及其定量分析观察TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞BMP蛋白表达的影响.结果 TGF-β(3~7 d)对ALP活性有促进作用,并呈一定的时效和量效关系.TGF-β对骨结节形成低剂量时有促进作用,高剂量时有较强的抑制作用;TGF-β对成骨细胞BMP蛋白表达表现为抑制作用;二者均有显著性差异.结论 TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨及BMP蛋白表达表现为双相作用.

  • 骨髓间充质干细胞在软骨细胞培养条件下生物学特点的观察

    作者:周强;李起鸿;杨柳;段小军

    目的观察骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)在软骨细胞培养条件下传代培养的主要生物学特性.方法梯度离心分离幼兔骨髓有核细胞,培养分离MSCs并进行传代培养,观测在体外软骨细胞培养条件下MSCs形态、生长特点及Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体合成分泌以及碱性磷酸酶活性等方面的变化.结果①MSCs原代细胞呈可见的均匀分布的簇状生长,呈长梭形,在传代培养中形态特性无明显变化、均质性明显提高;②各代Ⅰ型胶原免疫组化均为阳性,Ⅱ型胶原免疫组化均为阴性.③在各代培养中碱性磷酸酶染色均为阴性,对甲苯胺蓝存在极弱的异染性反应;④细胞外基质中硫酸糖胺多糖含量亦很低.结论传代培养中骨髓MSCs保持了常规低糖培养条件下的基本生物学特点,说明常用的软骨细胞基础培养条件同样适合骨髓MSCs的培养.

  • 骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

    作者:谭祖键;胡蕴玉

    目的通过基因转染方法,用骨形态发生蛋白3(BMP3)基因转染成纤维细胞(NIH-3T3细胞),观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化,初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径.方法定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体,脂质体介导法转染NIH-3T3细胞,G418筛选获得稳定转化体,观察不同时期被转染细胞的形态学变化,钙钴法染色转染细胞不同时相的碱性磷酸酶并作图像分析.结果转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达.转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状,转染后2周细胞由长梭形变为多角形,转染后4周细胞变为多边形,类似成骨细胞,钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染成黑色的碱性磷酸酶颗粒,及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组,两组间有显著性差异(P<0.01).结论通过向NIH-3T3细胞内转染BMP3基因,可以使NIH-3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化,被转染细胞内碱性磷酸酶水平明显增高,已具有成骨细胞的某些特性.

  • 转化人关节软骨细胞的Ⅱ型胶原表型诱导

    作者:何清义;李起鸿;许建中;杨柳

    目的用离心管聚集体培养(Aggregate culture)诱导转化人关节细胞的Ⅱ型胶原.方法将体外长期培养的第30、40、50代转化软骨细胞消化后进行离心管培养,比较细胞在单层培养、离心管聚集体培养,以及在普通培养基,BAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白(BMP-2)+抗坏血酸盐(Ascorbate)+胰岛素(insulin)],Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达和胞外基质产生情况.结果在单层培养条件下,转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原,而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下转化软骨细胞表达丰富的Ⅱ型胶原和大量胞外基质. 结论离心管聚集体培养是诱导转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式.

  • BMP及TGF-β复合生物材料治疗股骨头坏死的组织学观察

    作者:周强;石国华;杨柳;谭祖键;戴刚;唐康来

    目的观察吸附有BMP-2和TGF-β1的PLLA/CPPf多孔材料植入股骨头坏死(Femur head necrosis,FHN)病灶清除区后的组织学变化,评价其诱导成骨活性及生物降解性,以探索FHN治疗的新方法.方法在激素诱导性兔FHN模型上行坏死病灶清除术,以该种材料充填骨腔,行大体和组织学光镜观察.结果①大体观察,术后2周充填区周边出现反应带;6周周边反应带基本消失,有骨小梁长入充填区;12周骨小梁已布满充填区.②光镜观察,术后1周充填区周围间充质细胞大量增生,纤维肉芽组织形成,开始且持续呈网状长入充填区;2周周边有新骨产生,以后不断增加并向充填区中心延伸,材料逐渐降解,12周充填区广布相对较成熟的骨小梁.结论 PLLA/CPPf多孔隙材料是生长因子的良好吸附载体,具有较好的生物相容性和生物可降解性,适合活组织长入.吸附有BMP-2和TGF-β1的PLLA/CPPf多孔隙材料具有较强的诱导成骨能力,能有效地提高在骨坏死病理条件下股骨头的骨修复能力.

  • 体外培养成骨细胞合成分泌TGF-β1的研究

    作者:卢卫忠;杨柳;吴梅英;唐康来;贺小兵;许建中;李起鸿

    目的研究体外培养成骨细胞合成分泌TGF-β1的功能.方法利用胎兔颅骨成骨样细胞体外培养模型,应用免疫组化和酶联免疫吸附试验检测成骨细胞分泌TGF-β1的情况.结果体外培养的成骨细胞能够分泌TGF-β1,随传代培养次数增加和培养时间延长,TGF-β1浓度增加,在第3代和第7天时增加明显,以后逐渐下降.结论体外培养的成骨细胞具有分泌TGF-β1的功能,呈一定的时效关系,并和传代次数有关.

  • 细胞-支架复合体构建及其异体移植修复关节软骨缺损的形态学观察

    作者:戴刚;李起鸿;周强;石国华

    目的探讨应用组织工程技术进行异体移植修复关节软骨缺损的有效性和可行性.方法采用动态倒置显微镜与扫描显微镜观察及大体、组织学和免疫组织化学观察方法,以优化获取的单层传代培养幼兔关节软骨细胞及结构与性能优化的CPPf(Calcium polyphosphate fibers, CPPf)/PLLA (poly-L-lactic acid, PLLA)自制支架复合材料,进行细胞-支架复合体体外构建与培养及其异体移植修复关节软骨缺损的病理形态学实验研究.结果将适宜密度培养细胞种植于支架材料中,细胞密集,分布均匀;经一定时间体外培养,其种植细胞与支架材料粘附、生长繁殖并分泌细胞外基质;支架材料保持培养前的外形与内部微结构.其细胞-支架复合体异体移植修复关节软骨缺损的病理形态学特征为:①修复后的关节面光滑,与周围组织整合良好;②软骨细胞呈柱状排列;③Ⅱ型胶原及硫化糖胺多糖在空间上分布均匀;④软骨下板得以重建;⑤修复组织与其下方骨质紧密结合;⑥支架材料逐渐降解吸收.结论应用细胞-支架复合体异体移植进行关节软骨缺损修复,具有种植细胞来源广泛、可根据缺损大小和形状设计支架外形、使缺损完全生物学再生修复的优点.这一组织工程技术为关节软骨缺损完全再生修复提供了一条新的有效途径.

  • 骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

    作者:段小军;杨柳;王铁翔;谭祖键

    目的提取牛骨形态发生蛋白,并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用,为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的骨缺损修复研究提供实验依据.方法从小牛骨中提取骨形态发生蛋白,配制条件培养液,并作用于培养状态的人骨髓基质细胞,染色检测细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达情况,放免法测定培养液中骨钙素含量.结果人骨髓基质细胞经诱导培养后,碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素表达明显增加.结论体外培养时,天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化.

  • 逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

    作者:何清义;李起鸿

    目的研究HPV16E7(human papillomavirus 16 E7) 基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性.方法利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞,检测HPV16E7基因的整合与表达,并用生长曲线、血清依赖试验,电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察,了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性.结果挑选出了能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆,已传代50代,PCR及RT-PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录,转化细胞的生长速度要高于正常软骨细胞,二者都对血清有较大程度的依赖,转化细胞的核质比大,核仁明显,S期细胞数显著高于正常软骨细胞.结论经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强,可连续传代达50代.

  • 高数量骺板软骨细胞聚集培养生成软骨组织的观察

    作者:周强;李起鸿;戴刚;杨柳

    目的观察高数量骺板软骨细胞的离心管内长期聚集培养生成软骨组织的大小和生物学特点,并对这一培养技术进行初步评价.方法酶消化法分离幼兔骺板软骨细胞,以90×104原代细胞经离心沉降于15 ml塑料离心管底聚集培养,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察.结果培养生成的软骨,随培养时间的延长体积逐渐增大,4周时直径大为4.5 mm;外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜,由多层细胞构成,随时间的延长而减少;中心部位为肥大的软骨细胞,随培养时间的延长而增多.2周后,甲苯胺蓝染色呈强的异染反应,Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性;Ⅰ型胶原的免疫组化着色明显减弱,主要位于外周.结论离心管内工程化软骨构建技术所需操作简便、设备简单,生成的工程化骺板软骨具有良好的软骨结构和富含软骨特异性基质成分,增加细胞数量可使形成的软骨体积有所增大,但其大小和形状仍很有限.

  • 骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

    作者:周强;李起鸿;杨柳;戴刚

    目的观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点,初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能.方法将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察.结果骺板软骨细胞-生物凝胶复合物,在体外培养过程中不能维持其初始外形,培养1周直径可收缩为初始的45%,但能保持种子细胞的稳定均相分布.经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织,表面为由1~3层梭形细胞组成的膜样结构,内部细胞主要为圆形细胞,有细胞外基质相隔,形成软骨细胞陷窝.基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性,位于表面膜结构.结论这一生物凝胶具有良好的细胞相容性,适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨,但难以维持其初始外形.

  • 两种自制支架材料对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响

    作者:戴刚;石宗利;李起鸿;李重庵

    目的评定两种自制支架材料DL-聚乳酸支架、聚磷酸钙纤维对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响.方法采用材料样品与体外单层培养关节软骨细胞直接接触法,并对其进行倒置显微镜观察、培养细胞计数与DAN含量及其细胞外基质35S掺入量和羟脯氨酸含量测定.结果两种支架材料可与培养关节软骨细胞完全相容,无关节软骨细胞毒性;对培养关节软骨细胞的DNA、蛋白多糖及胶原合成无异常影响.结论两种支架材料具有良好的关节软骨细胞相容性,对其功能物质的合成无异常影响,经其结构与性能优化,即可满足关节软骨组织工程制备技术的各项要求.

  • BMP诱导成骨过程中胶原生成及TGF-β1的促进作用

    作者:谭祖键;李起鸿;许建中;杨柳;曹佳;潘峰;孙玮

    目的探讨骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)诱导成骨过程中骨胶原氨基酸的变化规律及转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1 , TGF-β1)对骨胶原生成的影响,进一步阐明BMP的诱导成骨机制和TGF-β1对骨损伤修复的调节机制.方法实验采用日本大耳白兔左尺骨中上段12mm骨缺损实验模型,随机分为实验组、对照组及空白组,缺损内分别植入BMP/TGF-β1/载体、BMP/载体及单纯载体.分别于术后第1、2、3、4、5周检测各组缺损区胶原羟脯氨酸(Hydroxyproline, HP)及羟赖氨酸(Hydroxylysine, HL)量的变化,并作胶原VG染色图像分析、组织学及电镜观察.结果实验组较同期对照组及空白组胶原HP生成量增加,成骨细胞数量增多,Ⅰ型胶原生成时间提前、生成量增加,胶原总量也明显增加,骨损伤修复时间缩短.结论 TGF-β1可使骨胶原在BMP诱导成骨过程中生成增加.TGF-β1通过促进成骨细胞生成使Ⅰ型胶原分泌能力增强,并抑制Ⅱ型胶原产生使软骨期缩短,骨损伤修复提前.BMP、TGF-β1两者在骨损伤修复中相互加强,具有协同作用.

  • 人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

    作者:何清义;李起鸿

    目的构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)的逆 转录病毒载体.方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段,并用酶切、连接 等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上,然后再用酶切、测序进行鉴定.通过Ge nbank 的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析.结果经酶切分析、测序证明,从HPV16 cDNA克隆的300 bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组,HPV 16E7基因片段与数据库中的原HPV16 cDNA的E7有高度的同源性.结论构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础.

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