肉毒杆菌毒素A水凝胶对大鼠骨骼肌远期作用的形态学观察

目的 探讨肉毒杆菌毒素A(botulinum toxin A,BTXA)水凝胶对大鼠骨骼肌(腓肠肌)远期作用的形态学影响及其意义.方法 将BTXA行示踪标记配制125I-BTXA水凝胶与125I-BTXA水溶液,进行样品放射性强度测定.12只SD大鼠用随机数字表法分为A、B两组,每组6只,大鼠右侧腓肠肌注射BTXA水凝胶,左侧腓肠肌注射等体积生理盐水作对照,于注射后6个月(A组)、12个月(B组)切取腓肠肌标本,常规病理HE染色、1%氯化金染色,透射电子显微镜观察组织结构变化.结果 125I-BTXA水凝胶与125I-BTXA水溶液放射性强度比较无统计学差异(P＞0.05);光镜下大鼠腓肠肌组织形态无明显改变;透射电镜观察,注射后6个月,出现不可逆性肌纤维溶解,肌膜下线粒体嵴肿胀、空泡变,局部肌浆网增厚、扩张;注射后12个月,肌细胞损伤无明显改善.结论 BTXA在水凝胶中的浓度与在生理盐水中相当,BTXA水凝胶作用的骨骼肌远期超微结构形态不能恢复止常,其对骨骼肌在远期仍有影响.

外源性Wnt5a激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+信号途径研究

目的 观察外源性Wat5a对K562细胞非经典WntSa/Ca2+途径的影响,进一步研究外源性Wnt5a诱导K562细胞的分化机制.方法 激光共聚焦显微镜观察Ca2+内流的变化,以RT-PCR及免疫组化检测β-catenin的表达变化,以Western blot检测cyclin D1的表达变化.结果 外源性Wnt5a能明显促进K562细胞Ca2+内流,显著下调cyclin D1表达,且能下调K562细胞β-catenin表达,但β-catenin表达下调无统计学意义.结论 外源性Wnt5a能激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径,外源性Wnt5a诱导K562细胞分化机制可能与此相关.

产前基因检测杜氏肌营养不良

目的 产前基因检测杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家系胎儿.方法 利用性别决定基因SRY引物PCR和羊水细胞培养染色体核型分析确定3例DMD家系胎儿性别,采用mPCR技术对3个DMD家系成员外周血及胎儿羊水和脐静脉血进行DMD基因内18个外显子位点扩增,STR-PCR结合聚丙稀酰胺凝胶技术对DMD基因3'端及基因内的44、45、49、50内含子的(CA)n短串联重复序列引物进行扩增,进行家系连锁分析和产前基因诊断.结果 共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,之乙胎为女性.3个DMD家系2个检出为非缺失型,1个为缺失型.4例胎儿均继承了与同代先证者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD风险胎儿,3例患儿母亲均为杂合型.结论 STR多态连锁分析不仅适用于常见缺失突变检测未发现缺失的DMD患者,同样适用于缺失型DMD患者的产前基因检测.

体外培养豚鼠膀胱ICCs细胞表达NSE及nNOS

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase,NSE)及神经源性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养,对照组为原代培养的膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行c-kit及平滑肌肌动蛋白(SMA)染色,RT-PCR和Western blot法进行细胞培养后1、3 d和5 d的NSE及nNOS转录水平及蛋白水平的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞NSE及nNOS转录及蛋白水平较高,膀胱平滑肌细胞不表达NSE及nNOS.结论 豚鼠膀胱ICCs培养细胞表达神经细胞特异性物质,提示豚鼠膀胱ICCs细胞参与膀胱功能调控.

腺苷对小鼠前额叶皮质锥体细胞超极化激活阳离子电流的影响

目的 应用膜片钳全细胞记录技术,探讨腺苷对小鼠前额叶皮质锥体细胞的超极化激活阳离子电流(hyperpolarization-activated cation current,IH)的影响.方法 制备小鼠前额叶皮质脑片,在膜片钳全细胞记录模式下,观察腺苷对锥体细胞IH的调节作用.结果 记录的43个细胞中有41个观察到IH;腺苷能够使该电流幅度减小,并使Ⅰ-Ⅴ曲线显著下移(P＜0.01,P＜0.05),此效应呈剂量依赖性(P＜0.05).结论 腺苷具有抑制前额叶皮质锥体细胞IH的作用.

无功能移植肾切除对群体反应抗体的影响

目的 观察无功能移植肾切除对肾移植受者群体反应抗体(panel reactive antibody,PRA)及再次肾移植的影响.方法 收集我院2004-2007年收治的15例移植肾切除患者,分别于肾移植前,移植肾切除前,移植肾切除后1个月、半年、1年检测其PRA水平,同时行移植肾病理检查.部分患者经HLA配型检查后进行再次肾移植.结果 肾移植后受者PRA高于移植前,移植肾切除后1个月PRA水平进一步升高,在移植后半年及1年后逐渐降低.采用LAT板检查可发现新的HLA致敏位点,肾脏病理检查肾间质有多量C4d沉积.通过HLA配型避开致敏位点选择供肾,7例患者行再次肾移植均获成功.结论 移植肾切除可导致血清中PRA水平显著升高,PRA检查可发现新的HLA致敏位点,经良好HLA配型不影响再次肾移植.

大鼠实验性脑室出血后慢性脑积水动物模型的建立及病理学观察

目的 建立一种稳定、高效、死亡率低的成年大鼠脑室出血后慢性脑积水动物模型.方法 SD雌性大鼠110只,采用随机数字表法分为3组:生理盐水对照组及侧脑室注血组各50只,正常对照组10只.采用侧脑室注血法于侧脑室注入自体小抗凝血130μl制备大鼠脑室出血后慢性脑积水动物模型,以术后28 d时大鼠前囟后0.4 mm冠状面的侧脑室宽度评价脑积水的发生情况.分别于术后24 h、72 h、7 d、14 d及28 d处死大鼠,测量上述平而侧脑室指数(侧室面积/脑片面积×100),并观察脑室出血后脑组织病理结构变化.结果 正常对照组无脑积水,生理盐水对照组在各时相点未出现脑积水,侧脑室注血组28 d时10只大鼠中7只发生脑积水.28 d时侧室指数分别为正常对照组(0.79±0.49)、生理盐水对照组(1.05±0.41)、侧脑室注血组大鼠(4.51±1.94);侧脑室注血组与生理盐水对照组及正常对照组相比均有非常显著差异(P＜0.01).侧脑室注血组大鼠24、72 h脑室周围白质水肿,脑组织细胞增生,胼胝体出现扭曲和肿胀;7 d时侧脑室积血已经消散,出现含铁血黄素侧脑室壁沉积;28 d时室管膜细胞有纤毛和微绒毛的缺失.生理盐水对照组无以上变化.结论 采用侧脑室注血法可以制备大鼠脑室出血后慢性脑积水模型.

分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定

目的 用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定.方法 以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的Apa Ⅰ位点与SnaB Ⅰ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M. smegmatis)mc2 155中的表达情况.结果 从BCG基因组中扩增出160 bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致.测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M. smegmatis中成功表达.结论 成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70.

Claudin 3在食管腺癌和贲门腺癌的表达和意义

目的 探讨Claudin 3在食管腺癌和贲门腺癌的表达及意义.方法 分别采用RT-PCR及Western blot检测16例食管腺癌、20例食管鳞癌、15例弥漫型贲门腺癌、25例肠型贲门腺癌、15例正常食管黏膜和15例正常贲门黏膜组织中Claudin 3 mRNA及蛋白表达.结果 与正常对照组和食管鳞癌、贲门弥漫型腺癌组相比,食管腺癌和贲门肠化型腺癌组织中Claudin 3 mRNA及蛋白表达显著增高(P＜0.01);食管鳞癌组、贲门弥漫型癌组Claudin 3 mRNA及蛋白表达与正常对照组无明显变化(P＞0.05).结论 Claudin 3与食管腺癌和贲门肠化型腺癌发生有关.

内侧型蝶骨嵴脑膜瘤显微手术治疗

目的 探讨内侧型蝶骨嵴脑膜瘤显微手术技巧.方法 回顾性分析23例内侧型蝶骨嵴脑膜瘤显微手术治疗的临床资料,讨论显微手术治疗内侧型蝶骨嵴脑膜瘤的手术要点.结果 23例患者均行显微外科手术切除肿瘤.肿瘤全切15例,次全切6例,部分切除2例.无手术死亡,疗效满意.结论 采用经翼点入路,利用显微手术可以明显提高肿瘤全切率.肿瘤是否全切,取决于肿瘤的部位、质地、脑水肿的程度.对无法全切的肿瘤,可考虑姑息手术结合术后放疗.

西酞普兰对血管性痴呆大鼠海马DG神经发生和认知障碍影响的初步研究

目的 探讨西酞普兰对血管性痴呆大鼠海马齿回神经干细胞动员的作用及对动物空间认知行为的影响.方法 实验动物采用随机数字表法分为正常对照组(NC组)、假手术对照组(SC组)、血管性痴呆组(4VO组)和西酞普兰干预的血管性痴呆组(4VO+C组)共4组;采用改良的Pulsinelli's四血管阻断(4-vessle occlusion,4VO)方法制作血管性痴呆动物模型;BrdU免疫荧光和激光共聚焦方法观察海马齿回(dental gyrus,DG)神经干细胞增殖状况;Morris水迷宫检测大鼠空间学习和记忆功能.结果 ①海马DG的BrdU阳性细胞多成对或成团排列于颗粒细胞层与海马门区.4VO组及4VO+C组造模后1 d,BrdU阳性细胞数显著下降,此后逐渐增加,到术后14 d达峰值(4VO+C组约为4VO组的2倍),4VO+C组DG神经干细胞活跃增生的情况一直延续到术后21 d,与4VO组比较差异显著(P＜0.01).②Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验均表明,造模后大鼠空间学习记忆功能显著受损,但随时间推移逐渐改善;4OV+C组术后7 d和14 d组大鼠的学习记忆损伤程度较4VO组显著减轻(P＜0.05).③大鼠海马DG神经干细胞增殖趋势与其空间学习记忆能力改变无明显相关性.结论 全脑缺血再灌注可刺激大鼠海马DG神经干细胞增殖,且SSRI类抗抑郁药物西酞普兰可显著增强DG神经发生并减轻动物的空间学习记忆损伤,但神经干细胞增殖趋势与学习记忆改变无明显相关性,推测可能与增殖神经干细胞的分化、功能整合及神经递质作用等有关.

不稳定逼尿肌中ICCs细胞与逼尿肌收缩的关系

目的 研究不稳定逼尿肌中ICCs细胞的数量、分布形式的变化及其功能改变对逼尿肌肌条收缩的影响,初步探讨ICCs细胞与逼尿肌不稳定的关系.方法 近端尿道结扎法建立大鼠不稳定膀胱模型.分别于正常及不稳定膀胱的相同部位剪取3 mm×4 mm逼尿肌组织进行免疫荧光组织化学法检测c-kit阳性细胞的表达及分布情况;再于相同部位剪取2 mm×7 mm肌条进行收缩特性测定实验,并检测c-kit受体阻断剂对收缩的影响.结果 不稳定逼尿肌中c-kit阳性细胞的数量较正常逼尿肌明显增多(P＜0.05);正常逼尿肌中c-kit阳性细胞以散在分布为主,不稳定逼尿肌中以细胞网络形式存在;不稳定逼尿肌肌条的收缩频率和收缩幅度显著高于正常膀胱(P＜0.05);加入Glevic后,不稳定逼尿肌肌条的收缩幅度显著减弱(P＜0.05),频率无显著差异(P＞0.05).结论 不稳定膀胱中ICCs细胞的数量明显增加,主要以细胞网络的形式存在;不稳定逼尿肌肌条收缩幅度和频率明显增高,但其收缩幅度可以被Glevic削弱,提示ICCs与逼尿肌不稳定的发生有密切关系.

人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞的生物学特性研究

目的 获得人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞,了解其生物学特性.方法 采用本室建立的人永生化成骨细胞(hFOB1.19)恶性转化细胞株(转化细胞),用抗黏附培养法,模拟脱离基质情况,获得抗失巢凋亡细胞.电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪观察悬浮培养后不同时相点细胞的形态学改变和凋亡率.MTT法、Transwell小室分别检测细胞增殖情况和细胞的迁移能力.结果 形态学观察可见到典型的凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞悬浮后24、48、72 h的凋亡(PI染色)情况,凋亡率逐渐升高.抗失巢凋亡细胞再次悬浮同时相凋亡率与转化株相比下降;抗失巢凋亡细胞较对照组(转化细胞)的细胞增殖能力增强,迁移能力增强,转化细胞差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经过14 d的悬浮培养处理后,获得的人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞小仅抗失巢凋亡能力有所增强,增殖能力和迁移能力也有增强.

舱内腹部爆炸伤大鼠血清及肠道组织MDA含量和SOD、GSH-Px活力变化及意义

目的 探讨舱内爆炸致大鼠腹部损伤后血清及肠道组织MDA含量及SOD、GSH-Px活力的动态变化规律.方法 120只SD大鼠完全随机分为舱内组、舱外组,各60只,采用DDNP纸质点爆源在模拟装甲舱室和舱外开阔地爆炸建立腹部爆炸伤模型;另设立正常对照组(10只).爆炸后0.5 h内、3、8、24、48 h和72 h采集血液和肠道组织标本,检测MDA含量和SOD、GSH-Px活性.结果 大鼠爆炸后血清和肠道组织内MDA水平持续升高,伤后0.5 h内升高显著(P＜0.05),3～8 h上升快,24 h达峰值;舱内组较舱外组升高显著(P＜0.05).SOD、GSH-Px活性在伤后早期略有升高,继而进行性下降,24 h达低值;舱内组下降速度较舱外组快(P＜0.05).MDA水平达峰值及SOD、GSH-Px活性达低谷后逐渐恢复,舱内组恢复较慢.血清和肠道组织MDA含量及GSH-Px活力呈正相关(P＜0.01).结论 大鼠舱室爆炸致腹部损伤后氧化应激反应较开阔地爆炸出现早、强度大且持续时间长,氧化应激可能参与了大鼠腹部爆炸伤后肠道的继发性损害.检测血清MDA含量和GSH-Px活性可作为伤后肠道组织过氧化损伤的诊断指标之一.

钾通道阻断剂四氨基吡啶增加宫颈癌细胞对中子照射的敏感性

目的 研究钾通道阻断剂四氨基吡啶(4-amino-pynidine,4-AP)对宫颈癌HeLa细胞中子照射的影响.方法 宫颈癌HeLa细胞分别设小同浓度(0、1、5、10、20 mmol/L)4-AP组,0.67 Gy 252Cf中子照射后48 h,用MTT法和流式细胞仪检测各组细胞活性、凋亡率.0、20 mmol/L 4-AP组自照射后24、48、72 h分别用RT-PCR法、Western blot法检测HIF-1α mRNA及蛋白表达情况.结果 在中子照射48 h后,4-AP浓度为0、1、5、10、20 mmol/L时,对HeLa细胞增殖的抑制率分别为0、(38.81±3.45)%、(46.63±3.88)%、(63.58±6.19)%、(77.51±8.87)%,凋亡率(%)分别为(3.15 ±0.85)%、(8.01±1.19)%、(16.00±1.58)%、(47.20±3.18)%、(62.56±4.27)%,差异有统计学意义(P＜0.05).说明4-AP能抑制HeLa细胞的增殖,诱导凋亡,并呈现明显的剂量依赖性.当4-AP浓度大于5 mmol/L时,其作用明显(P＜0.01).0.67 Gy 252Cf中子照射0、24、48、72 h后,4-AP浓度为0 mmol/L组,HIF-1α mRNA/β-actin值分别为(0.423±0.116)、(0.464±0.111)、(0.487±0.121)、(0.415±0.099),Western blot灰度扫描结果HIF-1α/β-actin分别为(0.723±0.116)、(0.664±0.111)、(0.617±0.121)、(0.515±0.099),HIF-1α mRNA及蛋白表达均无明显降低,差异均无统计学意义(P＞0.05).4-AP浓度为20 mmol/L组,HIF-1α nRNA/β-actin值分别为(0.401 ±0.121)、(0.364±0.142)、(0.257±0.137)、(0.165±0.099),Western blot灰度扫描结果HIF-1α mRNA/β-actin分别为(0.879±0.117)、(0.645±0.115)、(0.312±0.114)、(0.130±0.118),HIF-1α mRNA及蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 钾通道阻断剂4-AP能降低中子放射治疗后缺氧诱导因子(HIF-1α)表达,降低HeLa细胞增殖,促进凋亡,提高HeLa细胞中子射线的敏感性.

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.

孕期母体炎症刺激对子代大鼠血压及学习记忆能力的影响

目的 探讨孕期母鼠的炎症免疫刺激对子代大鼠老年期的血压及学习记忆的影响.方法 24只孕鼠分别在孕期接受不同的处理,分为生理盐水对照组、内毒素(LPS)注射组、酵母多糖(Zym)注射组.子代大鼠出生后60周时,每组按随机数字表法选取8只,采用TNF-α ELISA试剂盒检测子鼠血清中炎症因子TNF-α的水平,用鼠尾动脉无创血压测定仪测量子鼠血压,通过Morris水迷宫实验检测其行为学变化,HE染色观察海马结构的病理改变.结果 孕鼠在孕期接受炎症免疫刺激后所生的子代大鼠在60周时,血清中TNF-α的水平、动脉血压值均明显升高,学习记忆能力下降,海马CA1区局部神经元排列紊乱、数量减少.结论 孕鼠孕期接受免疫炎症刺激可能是导致子代大鼠发生高血压和学习记忆能力降低的重要原因之一.

BMP-7基因修饰的骨髓间充质干细胞在小鼠肾脏内的表达

目的 构建BMP-7基因腺相关病毒,转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植入小鼠体内,观察其在肾脏的定植情况.方法 采用分子克隆技术,构建重组质粒pAAV-BMP-7.采用磷酸钙沉淀法,重组质粒与pAAV-RC、pHelper共转染HEK-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒.将此病毒颗粒转染BMSCs后,经尾静脉注射入小鼠体内,免疫组化方法检测其在肾脏的定植情况.结果 成功构建了BMP-7基因腺相关病毒,可以高效转染BMSCs,移植入小鼠体内后,该细胞可在肾脏内定植.结论 BMSCs能稳定、高效表达外源基因BMP-7,并可在肾脏内定植.

1例X连锁型视网膜色素变性家系的分子遗传学研究

目的 对1例来自云南省的X连锁型视网膜色素变性家系进行相关分子遗传学研究.方法 在本研究小组前期工作中对该家系已初步确定的X连锁型遗传位点--RP2和RP3处选取具有高信息量的9个微卫星位标进行精细单倍型分析.在定位的候选基因RP3基因即RPGR基因上,使用构象敏感凝胶电泳(conformation sensitive gel electrophoresis, CSGE)的方法对其1～14号外显子进行突变筛选的同时对已有报道的突变热点区--外显子ORF15进行直接测序以寻找致病突变.结果 通过精细定位扫描及相关单倍型分析,将该例家系的致病基因定位在RP3位点.RPGR基因1～14号外显子经CSGE的方法进行突变筛选,未发现有异常电泳条带;通过直接对突变热点区外显子ORF15的测序,在该例家系中检测到1个在国内外均有报道的热点突变:g.ORF15+483_484delGA.结论 g.ORF15+483_484delGA移码突变导致了该家系产生X连锁型视网膜色素变性.

大鼠膀胱与直肠神经的解剖学观察

目的 探讨膀胱与直肠之间的神经联系.方法 用荧光素逆行双标法进行研究.健康成年雄性SD大鼠15只,完全随机分为实验组(10只)和对照组(5只).实验组将荧光素碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)注入直肠右侧壁肌层,双苯甲亚胺(Bisbenzimide,Bb)注入膀胱右侧壁肌层内,对脊髓L1～S3节段进行追踪.结果 在实验组右侧L6～S3和L1～L3的背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)中发现荧光素双标细胞,对照组无舣标细胞.结论 腰、骶部的DRG细胞周围突有分支同时投射到直肠和膀胱,说明慢性便秘引起的排尿异常的发生机制可能与发生在DRG水平的轴突反射有关.

RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.

结缔组织生长因子通过PI3K/PKB抑制人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡

目的 探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是否具有抑制人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic sear fibroblast,HSF)凋亡的作用及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K/PKB)是否介导该效应.方法 体外培养HSF,实验分3组:①空白对照组,②CTGF刺激组(10 ng/ml),③PI3K抑制剂LY294002(10 μmol/L)预处理后CTGF刺激组(LY294002组).应用免疫印迹技术检测30 min后蛋白激酶B的活化情况,应用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 和空白对照组相比,CTGF组细胞凋亡指数下降,蛋白激酶B的活化水平升高,具有统计学差异(P＜0.05);LY294002组细胞凋亡指数上升,蛋白激酶B的活化水平没有升高,与CTGF组比较具有显著性差异(P＜0.05).结论 CTGF能够抑制HSF凋亡,PI3K/PKB介导该效应.

GBLP在人脐静脉内皮细胞中差异表达的验证

目的 验证经手性药物比较蛋白质组学筛选鉴定的差异表达蛋白G蛋白β亚单位2样1蛋白(guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP).方法 分别用80 μmol/L的R/S-普萘洛尔(R/S- propranolol,R/S-PRO)处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)3 h.采用比较蛋白质组学方法分离鉴定差异表达蛋白-GBLP,Western blot法和激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)分别验证经R/S-PRO作用后,HUVEC细胞中GBLP的表达丰度差异和细胞内定位.结果 Western blot和LSCM都证实,GBLP在S-PRO作用后的HUVEC中的表达丰度明显低于经R-PRO作用后的表达(P=0.011);GBLP定位于HUVEC的细胞膜和细胞质中,在细胞质中呈均匀分布,在膜上有局部聚集分布现象.结论 Western blot和LSCM验证结果与蛋白质组学鉴定结果一致.

神经酰胺对人内皮细胞凋亡及bax、bcl-2表达的影响

目的 观察外源性神经酰胺(C2-ceramide)对内皮细胞凋亡及相关基因bax和bcl-2表达变化的影响.方法 原代培养人脐静脉血管内皮细胞,加药组加入终浓度分别为5、12.5、25、50 μmol/L的C2-ceramide,对照组加入体积分数为0.1%的无水乙醇.采用TUNEL法检测细胞凋亡,用RT-PCR、Western blot技术对bax mRNA、bcl-2 mRNA及蛋白表达进行分析.结果 加药组内皮细胞的凋亡阳性率显著高于对照组(P＜0.05),且具有时间和剂量依赖性;加药组bax mRNA及蛋白的表达较对照组显著升高(P＜0.05),bcl-2 mRNA及蛋白的表达较对照组则显著降低(P＜0.05).结论 外源性神经酰胺通过上调bax及下调bcl-2表达水平,改变bax/bcl-2值,从而诱导内皮细胞凋亡.

p16INK4a蛋白在宫颈疾病中的表达特点及其与HPV感染的关系

目的 研究伴有高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hr-HPV)感染及无hr-HPV感染的宫颈癌(cervical cancer,CC)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宫颈炎中p16INK4a蛋白表达水平的变化及意义,探讨宫颈癌及癌前病变中p16INK4a蛋白表达与HPV感染的相关性.方法 应用免疫组化方法检测126例宫颈疾病(CC 40例,CIN 67例和宫颈炎19例)组织中p16INK4a蛋白的表达,其中,hr-HPV(+)宫颈疾病89例(CC 32例,CIN 48例和宫颈炎9例),hr-HPV(-)宫颈疾病37例(CC 8例,CIN 19例和宫颈炎10例),进行半定量分析及统计学检验.结果 40例CC中,p16INK4a全部阳性表达;48例hr-HPV(+)和19例hr-HPV(-)CIN中,p16INK4a阳性表达分别为39例和12例;9例hr-HPV(+)和10例hr-HPV(-)宫颈炎组织中,p16INK4a阳性表达均为4例.hr-HPV(+)或hr-HPV(-)宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中p16INK4a蛋白表达水平均依次升高.CC和CIN中p16INK4a蛋白表达与hr-HPV感染相互间无显著相关性(P＞0.05).结论 细胞周期抑制蛋白p16INK4a在CC及癌前病变中过表达,且与hr-HPV感染无关,提示p16INK4a蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其他恶性肿瘤中不同.检测p16INK4a蛋白表达有助于CC的早期诊断.

地塞米松血管内支架的涂层制备及体外缓释实验研究

目的 制备地塞米松血管内支架的涂层,观察体外缓释特性.方法 采用喷涂、浸涂两种方法制备支架,以高效液相色谱仪检测载药量,并进行体外药物缓释测定.结果 喷涂支架的载药量为(24.26±5.23)μg,浸涂4 d的载药量为(93.15±7.83)μg.浸涂4 d的支架,药物缓慢释放,15 d时释放84%.结论 制备的支架具有明显的缓释作用.

PDGF-BB和SDZ RAD对血管平滑肌细胞p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响

目的 探讨重组大鼠血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)和抗增殖剂SDZ RAD对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响.方法 构建含p27基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyl transferase,CAT)报告基因的重组体pXp27,将这个重组体瞬时转染大鼠VSMC,加入PDGF-BB和SDZ RAD干预,测定CAT活性.用RT-PCR法测定其对p27 mRNA表达的影响.结果 10 ng/ml的PDGF-BB使转染后的重组体CAT活性降低,且使VSMC p27 mRNA表达量显著下降.10 ng/ml的SDZ RAD则使重组体CAT活性增高,并使VSMC p27 mRNA表达量显著增加.结论 PDGF-BB或SDZ RAD分别在基因转录水平或促进p27抑制基因启动子活性,进而减少或增加其mRNA的表达.

正常与脑缺血大鼠脑皮质线粒体的比较蛋白质组学研究

目的 采用比较蛋白质组学方法观察正常与脑缺血大鼠脑皮质线粒体蛋白表达差异.方法 SD大鼠按随机数字表法分为正常组和缺血组,采用改进的栓线法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral antery occlusion,MCAO)模型,分离大鼠缺血及正常大脑皮层,纯化线粒体蛋白进行二维电泳和凝胶图像分析,对差异蛋白质用HPLC-Chip/MS纳流液质联用技术进行序列分析,经Spectrum Mill搜索NCBInr数据库后鉴定蛋白质.结果 正常与脑缺血大鼠脑皮层线粒体蛋白表达存在显著差异,这些差异蛋白经鉴定,主要为TUC-4b、肌酸激酶同工酶、HS1结合蛋白、线粒体核糖体蛋白S27、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、泛醌-细胞色素C还原酶、琥珀酸辅酶A还原酶、细胞色素氧化酶、F1-ATP beta链、热休克蛋白70、热休克蛋白60、脂酰辅酶A脱氧酶等差异线粒体蛋白.结论 脑缺血可以导致皮层线粒体相关蛋白表达改变,提示其作用可能与线粒体能量代谢、凋亡有关.

不同剂量厄贝沙坦对兔主动脉粥样硬化中环氧合酶2的影响

目的 检测环氧合酶-2(COX-2)在兔主动脉粥样硬化(AS)中的表达,探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)-1型受体拮抗剂厄贝沙坦(Irbesartan,Irb)对COX-2表达的影响及其可能的抗AS效应.方法 健康雄性新西兰兔30只,按随机数字表法分为对照组、高胆固醇组(HC)、小剂量Irb(Sirb)组(10 mg·ks-1·d-1)、中剂量Irb(Mirb)组(20 mg·kg-1·d-1)和大剂量Irb(Lirb)组(30 mg·kg-1·d-1),每组6只.喂养14周后,取各组兔主动脉,行AS斑块面积及主动脉内膜/中膜值测定,采用RT-PCR、免疫组化和Western blot法分别检测主动脉AS斑块中COX-2 mRNA和蛋白的表达.结果 Lirb和Mirb组AS斑块面积均较HC组显著缩小[分别为(14.84±2.51)%和(33.77±3.53)%比(61.74±4.33)%,P＜0.01].Lirb和Mirb组内膜/中膜值较HC组明显减小[分别为(0.11±0.07)和(0.50±0.08)比(0.92±0.07),P＜0.01].HC组COX-2 mRNA的表达较对照组显著增强[(1.01±0.04)比(0.024±0.01),P＜0.01];Lirb和Mirb干预后COX-2 mRNA的表达量明显下降[分别为(0.24±0.03)和(0.47±0.05),P＜0.01].14周时HC组主动脉AS斑块中COX-2蛋白表达明显增强,Mirb和Lirb干预后显著降低[免疫组化分别是(0.81±0.06)比(0.47±0.10)和(0.14±0.02)(P＜0.01),Western blot 分别是(1.10±0.05)比(0.89±0.02)和(0.51±0.04)(P＜0.01)].结论 COX-2参与AS的发生和发展,中剂量和大剂量Irb均能降低AS斑块中COX-2的表达而抗AS,Irb对AS的有益作用可能是通过抑制COX-2表达实现的.

尺桡骨间骨软骨瘤1例

1 临床资料患儿,女,8岁,主因左前臂不能旋转3个月就诊.查体见左前臂不能做旋前及旋后运动,不痛,皮温正常.X线平片示左尺骨干中上段见一骨性突起,带蒂,邻近桡骨受压硬化,诊为骨软骨瘤.见图1.

误诊为肺癌骨转移的多发性骨髓瘤1例

1 临床资料患者,男性,63岁,因"胸背部阵发性胀痛1+年,左侧腰部胀痛5个月,加重13 d"入院.

术中胆道造影CR技术的临床应用

随着计算机X线摄片技术(computed radiography,CR)的广泛普及,CR的高敏感度和宽容度使术中胆道造影摄片的成功率及影像质量亦提高[1].为了更好的面向临床提供优质的影像及诊断质量,我们与手术医师及麻醉师密切配合,控制好患者呼吸后,立即进行曝光,在较短的时间内完成注射造影剂并进行摄片,要求一次性配合完成.准确掌握曝光时间是影响术中胆道造影摄片的重要因素.现探讨术中胆道造影CR技术的临床应用.

旋转DSA三维重建技术在颅内血管造影中的应用

旋转数字减影血管造影(rotational DSA)及三维重建技术较常规DSA检查能克服影像中病变血管与周围血管重叠的问题而广泛应用于临床[1].为了探讨该技术在颅内血管造影中的应用,我院自2006年4～12月以来,对119例颅内血管造影进行了常规DSA、旋转DSA及三维重建技术检查,效果良好,现报告如下.

双肺弥漫性网格状斑片状阴影1例

1 临床资料患者,男性,52岁,机关干部.因咳嗽咯痰40余天,加重伴劳力性气促4 d以肺部间质性病变于2007年12月7日入我院.患者于2007年10月受凉后出现咳嗽,咯少许白色泡沫样痰液,伴有咽喉干痒不适.无发热、咯血胸痛,无潮热盗汗等不适.

HPLC法测定新鱼腥草素钠注射液的含量

新鱼腥草素钠(sodium new houttuyfonte)的化学名为十二酰乙醛亚硫酸氢钠,为天然鱼腥草的有效成分鱼腥草素(葵酰乙醛)同系列的亚硫酸氢钠加成物[1].我国现行的标准中采用重量法进行新鱼腥草素钠注射液的含量测定[WS-10001-(HD-0391)-2002][2].本研究建立了测定新鱼腥草素钠含量的液相色谱条件,适用于新鱼腥草素钠注射液的质量控制.

MRI在宫颈癌临床分期中的应用探讨

宫颈癌发病率为女性生殖道恶性肿瘤之首,治疗前正确判断患者临床分期从而选择合理的治疗方案特别重要.目前,主要通过妇科检查来对宫颈癌进行临床分期,这种方法有一定的主观随意性,准确率不高,文献[1]报道为61%～66%.MRI具有高的软组织分辨率和可多方位、多序列成像等特点,使其在肿瘤分期中越来越受重视.此研究通过对宫颈癌妇科检查和MRI相关特点分析,探讨MRI在宫颈癌临床分期中的价值.

性腺外内胚窦瘤8例临床分析

内胚窦(endodermal sinus tumor,EST)是一种高度恶性的生殖细胞肿瘤[1],临床少见.

不同浓度芬太尼配伍罗哌卡因用于剖宫产术后镇痛效应的临床观察

罗哌卡因对心脏及神经系统毒性较低,在低浓度范围内能产生良好的感觉-运动分离阻滞的效果,已广泛用于分娩镇痛和术后镇痛.研究证实硬膜外混合芬太尼能增强岁哌卡因分娩镇痛的效果[1],然而临床应用时对芬太尼安全有效浓度尚无定论.本研究拟通过观察不同浓度芬太尼混合同一浓度罗哌卡因对剖宫产术后硬膜外镇痛效应,探讨其临床适宜剂量.

关于计量单位的使用