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多氯联苯对小鼠肝微粒体CYP1A1酶活力及其mRNA表达的影响
多氯联苯是一种含氯有机化合物,因为具有良好的物理化学稳定性,自发明并实现工业生产以来被广泛用于各生产领域.但由于其极高的亲脂性和高生物富集性,多氯联苯对生物体诸如免疫功能、激素代谢和生殖遗传等各个方面有重要影响[1].细胞色素CYP450是机体中混合功能氧化酶系中重要的一族氧化酶,主要分布在肝脏,参与了包括药物、致癌物及其他环境化合物在内的许多外源性物质的生物转化[2-3].
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钒对小鼠肝微粒体代谢酶的影响
钒化合物在工业上可用作化学试剂、催干剂、催化剂、还原剂和媒染剂等,陶瓷工业广泛用作釉料,这些工业排出的"三废"造成钒对环境的污染.天然岩石的风化,煤、石油等燃料的燃烧,钒钛磁铁矿等含钒矿物的开采等都造成了钒对环境的污染[1-4].元素钒的化学迁移性很强,可以在水、大气、土壤及生物体所构成的环境圈内迁移,形成污染循环[4].
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肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系在药物体外肝代谢研究中的应用进展
目的介绍肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系在药物体外肝代谢中应用进展.方法根据近几年的文献资料进行分析、综合、归纳,分别按肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系进行介绍.结果与结论两种方法在药物体外代谢研究上既有统一又可互补,二者相结合可更有效的应用于药物的高通量筛选、代谢物种选择及代谢物生成等研究领域.
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认识酒精性肝病
酒精性肝病是由于酒精摄入过量而导致的肝脏疾病.当乙醇进入肝细胞后,经肝细胞内乙醇脱氢酶、氧化氢体分解酶和肝微粒体乙醇氧化酶等三条途径氧化为乙醛.乙醛对肝细胞有明显毒性作用,直接和间接导致肝细胞变性、坏死及纤维化,严重时可发展为肝硬化.在酗酒严重的西方国家,酒精性肝硬化可占肝硬化患者的50％～70％.
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999感冒灵对不同种属CYP2E1酶活性的影响
目的:研究999感冒灵(感冒灵)对大鼠肝脏的影响,比较感冒灵对大鼠、小鼠和人不同种属CYP2E1酶活性的影响,为临床安全性再评价及合理使用提供实验依据.方法:大鼠随机分为空白组、感冒灵组(4.53 g·kg-1),单次灌胃给药,14d后动物称重,处理;全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),尿素氮(BUN),肌酐(SCr),肌酸激酶(CK),取肝脏、肾脏及心脏,计算脏器指数;对肝脏进行苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察其组织形态学变化.将人、大鼠和小鼠肝微粒体分别与不同浓度的感冒灵或对乙酰氨基酚(APAP)在37℃预孵育15 min后,加入CYP2E1的探针底物氯唑沙宗和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)继续孵育30 min,用LC-MS/MS方法测定6-羟基氯唑沙宗的生成量,计算半数抑制浓度(IC50).结果:与空白组比较,感冒灵组大鼠肝脏、肾脏及心脏指数、血清生化指标、肝脏病理组织学无明显变化.感冒灵在人、大鼠和小鼠的肝微粒体中对CYP2E1的IC50分别为6.516,344.2,932.8 mg·L-1,APAP在人、大鼠和小鼠的肝微粒体中对CYP2E1的IC50分别为52.4,453.8,806.5 mg·L-1.各种属中感冒灵和APAP对CYP2E1抑制程度趋势一致.结论:不同种属对感冒灵抑制CYP2E1活性敏感程度依次为人、大鼠及小鼠,该差异可能与大剂量感冒灵对大鼠肝脏无明显毒性影响有关;提示药物在进行临床前安全性评价时宜采用不同种属动物尤其是考察对肝脏代谢的影响,在临床需关注含有APAP的复方感冒药与其他药物联合用药时对体内药酶代谢的互相作用的影响,为临床合理用药提供依据.
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UPLC测定肝微粒体中柚皮苷和柚皮素含量
目的:建立UPLC测定大鼠肝微粒体中柚皮苷和柚皮素含量的方法,并初步考察二者于不同时间点的代谢情况.方法:采用UPLC色谱系统,ACQUITY BEH C18色谱柱(3.0 mm×100mm,1.7 μm),流动相甲醇-0.1％乙酸水溶液梯度洗脱,流速0.5 mL·min-1,柱温30℃,检测波长283,289 nm,内标为槲皮素,进样量3 μL.结果:柚皮苷及柚皮素均与槲皮素分离良好且无内源性干扰.生物样品中柚皮苷和柚皮素的线性范围分别为3.814 ～ 38.143(r=0.9992),3.586 ～ 35.857mg·L-1(r＝0.9996);柚皮苷的方法回收率95.43％ ～97.95％,绝对回收率97.33％ ～ 98.18％;柚皮素的方法回收率95.27％～99.31％,绝对回收率97.71％ ～99.73％;柚皮素在体外肝微粒体中的Ⅰ相代谢较柚皮苷显著.结论:该方法快速、灵敏、准确,可用于大鼠肝微粒中柚皮苷和柚皮素的含量测定.
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芫花醇提物对不同种属体系UGTs及UGT1A1活性的影响
目的 考察芫花醇提物对UGTs及UGT1A1活性的影响,为阐释芫花毒性机制提供依据.方法 采用体外肝微粒体孵育模型,以4-硝基酚为底物检测UGTs活性,以β-雌二醇为底物检测UGT1A1活性,利用UV和HPLC测定底物及代谢物含量.结果 芫花醇提物中3种黄酮类成分芹菜素、羟基芫花素、芫花素含量分别为6.34%、8.72%、6.06%,UV测得总二萜含量为31.40%.体外实验表明,在大鼠肝微粒体(RLM)和人肝微粒(HLM)孵育体系中,芫花醇提物均能显著抑制UGTs活性;对UGT1A1活性,在RLM、HLM和重组酶(rhUGT1A1)孵育体系中,芫花醇提物均表现为中等强度的抑制作用,以羟基芫花素计,半数抑制浓度分别为46.32、32.49、8.382μmol/L,抑制类型分别为竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用和竞争性抑制作用.结论 芫花醇提物对不同肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性,这种抑制作用可能是芫花致肝损伤的机制之一.
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肝微粒体和肝S9转化藜芦酸葡萄糖酯比较研究
目的 比较2种体外肝代谢模型转化藜芦酸葡萄糖酯的转化样式和转化率差异.方法 通过大鼠肝微粒体和肝S9体外转化模型对藜芦酸葡萄糖酯进行生物转化,采用HPLC检测转化底物及产物的含量,检测波长254 nm,流动相为乙腈(A)-1％乙酸溶液(B),梯度洗脱(0～6 min,5％～40％A;6～9 min,40％～50％A;9～11 min,50％～5％A),流速1.0 mL/min.结果 2种模型均可将藜芦酸葡萄糖酯转化为藜芦酸,但应用肝S9模型得到的代谢产物多于肝微粒体模型,且肝S9模型对酯类的转化率高于肝微粒体模型.结论 肝S9模型对酯类的转化能力高于肝微粒体模型.
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川芎嗪在大鼠肝微粒体系统中的代谢研究
目的:通过离体和整体实验来研究川芎嗪(TMPz)代谢转化过程,探讨参与TMPz代谢的CYP450亚酶,为临床上合理用药提供科学依据.方法:建立TMPz的UV-HPLC检测方法,测定大鼠血浆和肝微粒体温孵液中TMPz及代谢产物,分析TMPz代谢消除率与各诱导和抑制剂之间的相关性;Nash法测定肝微粒体温孵液中ERY N-脱甲基酶活性,探索其与代谢物生成量之间的相关关系;测定DEX,Ket在体诱导或抑制后,大鼠血中的TMPz药物浓度,计算和比较药动学参数.结果:特异性CYP3A诱导剂DEX组中TMPz代谢物生成速率明显高于对照组,而主要诱导CYP2B的阳,β-NF组与对照组无明显区别;强效的CYP3A抑制剂Ket则显著抑制TMPz的代谢;TMPz的代谢速率与CYP3A的特征性ERY N-脱甲基反应呈现高度的相关性;在体诱导或抑制后TMPz的药动学参数中DEX组的CL(s)大于对照组,t1/2小于对照组;而Ket抑制的CL(s)小于对照组,t1/2大于对照组,差异均具有统计学意义.结论:CYP3A是介导TMPz生物转化的CYP450亚酶,川芎嗪与CYP3A酶抑制或诱导药合用可能存在药物间的相互作用.
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Beagle犬肝微粒体中葛根素的HPLC-ESI-MS测定及代谢动力学研究
目的:建立Beagle犬肝微粒体中葛根素及其代谢物的液相色谱质谱测定方法,并对葛根素在Beagle犬肝微粒体中的代谢动力学进行研究.方法:超速离心法制备Beagle犬肝微粒体;Shimadzu-ODS色谱柱(2.0mm×150 mm,5 μm);流动相甲醇-水梯度洗脱,正离子模式,选择离子扫描m/z 417(M+H)+(葛根素),m/z 531(2M+Na)+(大豆苷元).结果:在体外代谢系统中,葛根素在Beagle犬肝微粒体中被代谢为大豆苷元,其酶促动力学参数Vmax为(0.047±0.006)mg·min-1·g-1,K为(1.22±0.53)mg·L-1.结论:该HPLC-MS法能够准确灵敏测定犬肝微粒体中葛根素和大豆苷元;葛根素在Beagle犬肝微粒体中被P450酶代谢为大豆苷元,同时为白葛胶囊后续研究奠定基础.
关键词： 葛根素 大豆苷元 HPLC-ESI-MS 肝微粒体 体外代谢 -
3种中药成分对大鼠CYP3A4酶代谢的影响
目的:探讨3种中药成分(延胡索乙素、甲基莲心碱、三七总皂苷)对CYP3A4酶代谢活性的影响,以了解中药与CYP3A4酶底物联合用药时可能产生的相互作用.方法:采用超高速离心法制备大鼠肝脏微粒体,建立体外肝脏微粒体混合酶代谢体系.以睾丸酮作为底物探针,用HPLC建立检测CYP3A4酶代谢活性的方法,分别考察体外代谢体系的适宜底物浓度、代谢时间、pH、孵育温度以及磷酸盐浓度.在确定的条件下,将3种中药成分稀释成不同浓度,分别与睾丸酮共同孵育于肝微粒体代谢体系中,测定在有或无中药成分存在下代谢产物6β-羟基睾丸酮的产生量,以评估中药成分对CYP3A4酶代谢的影响.结果:在肝微粒体孵育体系中,睾丸酮代谢为6β-羟基睾丸酮适宜的体外代谢条件为底物浓度200μmol·L~(-1),代谢时间3.5 h,pH 7.0,孵育温度37℃,磷酸盐终浓度0.1 mol·L~(-1).延胡索乙素和三七总皂苷均对CYP3A4酶的抑制作用较弱,IC_(50)>100μmol·L~(-1),甲基莲心碱有一定的抑制作用,IC_(50)为(47.5±2.3)μmol·L~(-1).结论:延胡索乙素和三七总皂苷对CYP3A4酶代谢无明显影响,提示这2种中药成分与CYP3A4酶底物之间的相互作用较低,甲基莲心碱有可能会产生微弱的药物相互作用.
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清开灵注射液对大鼠CYP1A2和2D6的影响
目的:通过清开灵注射液的大鼠体内、外实验,观察清开灵注射液对大鼠CYP1A2亚型,CYP2D6亚型的影响.方法:通过HPLC法测定全血中咖啡因的代谢率,观测清开灵注射液对大鼠CYP1A2活性的影响;通过HPLC法测定大鼠肝微粒体重组系统非那西丁的代谢比率,确定清开灵注射液对大鼠肝微粒体CYP1A2亚型的作用;测定大鼠肝微粒体重组系统右美沙芬的代谢比率,确定清开灵注射液对大鼠肝微粒体CYP2D6亚型的作用.结果:实验组中给予大鼠不同浓度的清开灵注射液(0.15,0.3,0.6 mL·kg-1),其咖啡因代谢率为(15.9±3.8)%,(14.5±1.8)%,(12.3±1.2)%,对照组为(16.8±5.9)%,各剂量组及对照组间均无显著性差异;肝微粒体体外重组系统中,实验组各浓度清开灵注射液对CYP2D6没有影响;高剂量组清开灵注射液对CYP1A2有抑制作用.结论:清开灵注射液对CYP1A2和CYP2D6的活性没有影响.
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HPLC-MS/MS测定葛根芩连汤对大鼠肝脏细胞色素P450酶的影响
研究葛根芩连汤及其主要药效成分对大鼠肝微粒体CYP450酶5种同工酶活性的影响.采用体外肝微粒体孵育技术将葛根芩连汤及其主要药效成分与各个探针底物共同孵育,利用LC-MS/MS建立CYP450 5种亚型探针底物的代谢产物的分析方法,考察微粒体蛋白浓度和孵育时间与代谢产物生成量之间的关系来确定蛋白浓度和孵育时间.运用HPLC-MS/MS检测CYP450酶5种同工酶特异性探针底物(非那西汀、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、睾丸酮)相应代谢产物(对乙酰氨基酚、4-羟基氯唑沙宗、右菲烷、6-羟基氯唑沙宗、6β-羟基睾酮)的生成速率(V)来确定CYP450的各亚酶活性.结果表明,对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、右菲烷、6-羟基氯唑沙宗及6β-羟基睾酮线性关系良好,精密度、稳定性、平均回收率符合要求,所建方法可行;优化的肝微粒体体外孵育条件,符合药物相互作用指导原则的要求;葛根芩连汤对CYP450 5个亚型(CYP1A2,CYP2C11,CYP2D2,CYP2E1,CYP3A1/2)酶均有不同程度的抑制,其主要药效成分中小檗碱在高浓度下可对各亚型酶有一定的抑制(CYP1A2,CYP3A1/2除外).
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羟基芫花素对UGTs及UGT1A1活性抑制作用种属差异的体外研究
考察羟基芫花素对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)及UGT1A1活性的影响,为预测其与其他药物的代谢性相互作用提供理论借鉴.该实验采用体外肝微粒体孵育模型,以4-硝基酚(4-NP)为底物检测UGTs活性;β-雌二醇为底物检测UGT1 A1活性,利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量.结果表明,在大鼠、小鼠和人肝微粒体(HLM)孵育体系,羟基芫花素能显著抑制UGTs活性;对UGT1A1,在小鼠肝微粒体(MLM)孵育体系中,羟基芫花素几乎无抑制作用(IC50=190μmol·L-1);在大鼠肝微粒体(RLM)和重组酶(rUGT1 A1)孵育体系中,羟基芫花素表现为中等强度的抑制作用(IC5o=10.93,20.07 μmol·L-),抑制类型分别为竞争性抑制和线性混合型抑制;在HLM孵育体系中,羟基芫花素表现为弱抑制作用(IC50=76.31 μmol·L-1),抑制类型为竞争性抑制;其抑制强弱顺序为RLM＞ rUGT1A1＞HLM＞ MLM.综上,羟基芫花素对不同肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1 A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性,提示羟基芫花素可能存在基于UGT1 A1酶的药物相互作用.该研究可为合理开发利用羟基芫花素提供实验依据,并为研究药物在临床上的联合用药提供理论借鉴.
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黄芪甲苷对大鼠肝微粒体酶活性影响
目的:研究黄芪甲苷对CYP450酶的影响,为制定合理用药方案提供科学依据.方法:以甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、香豆素、硝苯地平、非那西丁为探针药,HPLC测定探针药与相应代谢产物的浓度,在体外的孵育体系中研究黄芪甲苷对CPY2C9,CPY2E1,CPY2A6,CPY3A4和CPY1A2酶活性的影响.结果:黄芪甲苷对CYP1A2,CYP2A6,CYP2E1酶的活性没有明显的影响,而对CYP2C9和CYP3A4酶的IC50分别为35.40,88.22μmol·L-1.结论:黄芪甲苷对CYP2C9和CYP3A4酶有明显的抑制作用,在与经由CYP2C9,CYP3A4酶代谢的药物合用时,可能会产牛药物相互作用.
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四物汤及其配伍对大鼠肝脏P450酶活性及mRNA表达的影响
研究四物汤复方及其配伍对大鼠肝脏P450酶活性及其mRNA表达水平的影响.大鼠口服灌胃四物汤及其配伍水煎液2周后,处死,用生理盐水灌流肝脏,制备肝微粒体,采用混合探针与肝微粒体体外孵育法考察四物汤对大鼠肝脏细胞色素P450酶的影响.利用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测四物汤对大鼠肝脏细胞色素P450 mRNA表达的影响.四物汤复方组CYP1A2酶活性与对照组相比升高(P＜0.05),熟地白芍、当归白芍、当归川芎以及白芍川芎组的CYP1 A2和CYP2C19的酶活性与对照组相比降低(P＜0.05),复方组、单药组、2味药配伍组的CYP2B6的酶活性与对照组相比降低(P＜0.05).复方组对CYP1 A2的mRNA表达具有上调作用(P＜0.05),4味单药对CYP2B1 mRNA表达具有下调作用的(P＜0.05).四物汤复方对大鼠肝脏CYP1 A2的酶活性具有诱导作用,熟地和当归组与对照组相比酶活性相当,但与白芍合用后显著下调了CYP1 A2的酶活性.复方及其配伍对CYP2B6的酶活性具有抑制作用,其中当归对酶活性下调作用较强.复方对CYP1 A2以及4味单药对CYP2B1的mRNA表达的影响与酶活性水平相平行.
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17-氢-9-去氢穿心莲内酯体外代谢速率及代谢产物研究
应用体外大鼠肝微粒体孵育体系,研究喜炎平注射液中主要有效成分17-氢-9-去氢穿心莲内酯(DHA)的体外代谢速率及代谢产物.将17-氢-9-去氢穿心莲内酯与加入NADPH的大鼠肝微粒体共同孵育,采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定其剩余浓度,考察17-氢-9-去氢穿心莲内酯的肝微粒体代谢速率,并采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-TOF-MSE)对孵育体系中17-氢-9-去氢穿心莲内酯的代谢产物进行鉴定.研究结果显示在加入辅酶的大鼠肝微粒体中,17-氢-9-去氢穿心莲内酯代谢速率较快,其半衰期(t1/2)和肝微粒体中清除率(CL)分别为(19.7±0.5) min和(35.1 ±0.8)mL·min-1·g-1.高分辨质谱数据结合文献信息共鉴定孵育体系中17-氢-9-去氢穿心莲内酯的9个代谢产物,主要为羟基化产物和脱氢产物.鉴定结果为筛选出活性更好的穿心莲二萜内酯类衍生物提供了一定的依据.
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芫花氯仿萃取物对大鼠及人肝微粒体UGTs及UGT1A1活性影响
考察芫花氯仿萃取物对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)及UGT1A1活性的影响,为预测芫花致肝损伤可能发生机制提供实验依据.采用体外肝微粒体孵育模型,分别以4-硝基酚和β-雌二醇为底物检测UGTs及UGT1A1活性;利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量.结果表明,HPLC测得氯仿萃取物中3种黄酮类成分芹菜素、羟基芫花素和芫花素质量分数分别为1.00％,6.40％,18.38％;UV法测得总二萜质量分数为37.39％.与空白组相比,在大鼠肝微粒体(RLM)孵育体系,氯仿萃取物能显著抑制UGTs活性,而在人肝微粒体(HLM)孵育体系,抑制作用不明显;对UGT1A1,在RLM和HLM孵育体系中,氯仿萃取物均表现为中等强度的抑制作用(以芫花素计,IC50=8.76,10.36 μmol·L-1);抑制类型分别为非竞争性抑制和反竞争性抑制.综上,氯仿萃取物对UGTs及UGT1A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性,推测这种抑制作用可能是芫花致肝损伤的机制之一.
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临床用量的复方黄黛片及大剂量雄黄对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响
探究临床用量的复方黄黛片及大剂量君药雄黄对大鼠肝脏主要药物代谢酶(CYP450)酶活性的影响及在mRNA水平的调控作用.以Wistar大鼠为研究对象,受试药物给予14 d后,采用Cocktail体外孵育法结合HPLC-MS/MS技术对大鼠肝中CYP1A2,CYP2B,CYP3A,CYP2C各亚酶的活性进行测定,并利用实时荧光定量PCR技术对上述亚型的mRNA水平表达进行检测.结果显示,复方黄黛片显著诱导CYP1A2,CYP2B酶活性,抑制CYP3A酶活性,结果与mRNA的表达具有一致性,但其单味药却呈现出弱于其甚至是相反的现象;不同剂量的雄黄组之间对酶活性及mRNA的表达结果亦呈现非常显著的不一致性.这些现象可能与复方黄黛片的配伍增效或减毒有关.CYP450酶的研究结果亦可以提示,复方黄黛片与其他药物合用时有可能产生药物相互作用.
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抗肿瘤化合物E7在不同种属肝微粒体酶中的体外代谢研究
采用商品化的人、Beagle犬、食蟹猴、SD大鼠的肝微粒体酶,考察E7在4个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢的种属差异.采用选择性化学抑制剂,测定不同抑制剂对E7代谢速率的影响,分析预测大鼠肝微粒中参与E7代谢的主要亚酶.实验结果显示E7在人、犬、食蟹猴和大鼠4个种属的肝微粒体中体外代谢半衰期711/2分别为57.75,69.30,16.90,30.13min;体外固有清除率分别为0.0048,0.0040,0.016 4,0.009 2 mL·min-1·mg-1.推测E7在人和犬肝微粒体中代谢速率相近,均比较慢;在猴和大鼠肝微粒体中代谢速率相近,均比较快;代谢速率存在明显的种属差异.CYP2E1,CYP2A6,CYP1 A2和CYP2D6均可能参与代谢E7,而多态性的CYP3 A4对其的代谢贡献较小.
