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基于分类树模型鉴别药物在生物药剂分类系统的穿透性分类
通过构建基于分子属性的分类树模型以鉴别化合物的生物药剂分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)的穿透性分类.将从不同文献采集的Caco-2穿透性数据构成训练集,建立分类树模型,并应用此模型对外部测试集——美国食品药品监督管理局BCS的标准化合物进行分类测试.由此建立的鉴别化合物的BCS穿透性分类的规则为如果氢键供体原子数量＜4、正性范德华极性表面积和＜40.71并且溶解能＞-33.89,那么该化合物为高穿透性,否则为低穿透性.本分类结构属性关系模型的105个化合物的训练集和17个化合物的外部测试集的识别正确率分别91.43％和82.35％.本模型成功应用于鉴定BCS标准化合物高低穿透性分类药物的分子属性,为药物穿透性的识别提供了简便、有效的分类方法.
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高锌对Caco-2细胞铁、锌含量及其调控基因mRNA表达的影响
目的:探讨高锌对小肠细胞铁、锌含量和铁、锌调控基因DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达的影响.方法:以Caco-2细胞为小肠细胞体外模型,以锌浓度分别为4、50、100、 200 μmol/L的培养液培养24 h,用原子吸收分光光度计检测细胞内铁、锌含量,用RT-PCR方法检测DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达,以GAPDH mRNA水平作为内参照.结果:高锌处理24 h后Caco-2细胞内锌含量升高,培养基锌浓度为50 μmol/L时达到高峰,而细胞内铁含量却随培养基锌浓度升高而降低.细胞内DMT1、IREG1、ZnT1 mRNA表达均出现上调,hZIP4 mRNA表达则发生下调.结论:补锌可以提高小肠细胞内锌含量,但会使细胞内铁含量下降.铁和锌在小肠中的吸收可能相互影响.
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应用Caco-2细胞模型观察介质pH和氨氯地平对替米沙坦跨膜吸收转运的影响
目的 探讨介质pH值和常用合并用药氨氯地平对血管紧张素Ⅱ受体(AT1型)拮抗剂替米沙坦跨膜吸收转运的影响.方法 体外培养人结直肠癌Caco-2细胞,通过细胞形态观察、跨上皮细胞电阻(TEER)测定和荧光黄通透性实验验证Caco-2细胞单层完整性；通过ATP酶活性测定和双向转运实验分析替米沙坦是否外排糖蛋白(P-gp)底物；观察改变介质pH及合并使用氨氯地平时对替米沙坦跨膜吸收转运的影响.结果 建立的Caco-2细胞单层完整,适用于转运实验.替米沙坦ATP酶活性与空白对照ATP酶活性的比值为1.73,双向转运实验结果显示外排比率为4.53.随着pH值(8.0～5.0)的降低,替米沙坦吸收表观通透性逐渐增强,跨膜吸收转运呈现明显的pH依赖性.在pH 7.4且合并氨氯地平时,替米沙坦吸收表观通透性明显增强.结论 P-gp可能参与替米沙坦跨膜分泌转运,介质pH酸性环境和氨氯地平可易化替米沙坦跨膜吸收转运.
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丁酸盐激活CaMKK促进紧密连接重组装的研究
目的 探讨丁酸盐激活AMPK从而调节紧密连接的重组装的途径.方法 使用丁酸盐、CaMKK特异抑制剂(STO-609)处理上皮屏障模型Caco-2细胞,在转钙过程中检测电阻(TER)值、细胞内ATP水平以及CaMKK和AMPK的磷酸化状况,从而判断丁酸盐促进紧密连接重组装的上游信号通路.结果 丁酸盐处理Caco-2细胞后,其TER值显著增高(P＜0.05),CaMKK和AMPK均被磷酸化激活,而上述作用可被STO-609部分减弱.结论 丁酸盐可通过钙离子途径磷酸化激活CaMKK,继而活化AMPK促进紧密连接的重组.
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促红细胞生成素(EPO)对叶酸在Caco-2细胞中跨膜转运的影响
目的 采用人结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line) Caco-2单细胞层模型观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对叶酸跨膜转运的影响.方法采用Caco-2单层细胞模型,观察不同剂量EPO (0.3、1、3 U/mL)处理对叶酸在摄取与外排双向转运方面的影响.通过real time-PCR与Western blot观察EPO处理对质子偶联的叶酸转运体(proton coupled folate transporter,PCFT)、还原叶酸载体(reduced folate carrier,RFC)以及多药耐药相关蛋白2 (multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)表达的影响.结果EPO在剂量0.3~3 U/mL范围内可剂量依赖地增加叶酸在摄取方向的转运,增幅分别为31.6%、61.5%和120.5%.高剂量EPO(3 U/mL)对叶酸在外排方向的转运也具有促进作用,增幅为56.9%,而中低剂量EPO (1、0.3 U/mL)对叶酸外排无明显作用.叶酸转运体PCFT、RFC及MRP2均受EPO影响而表达上调,并呈剂量依赖和时间依赖关系.结论 EPO可上调叶酸的摄取并呈剂量依赖关系,高剂量EPO对叶酸的摄取与外排具有双向促进作用.
关键词： 叶酸 促红细胞生成素(EPO) Caco-2细胞 叶酸转运体 -
仙茅苷在Caco-2细胞模型中跨膜转运特征研究
目的：采用Caco-2细胞Transwell模型研究仙茅苷的跨膜转运机制。方法：建立Caco-2细胞Transwell吸收模型，用聚酯碳酸酯膜培养Caco-2细胞21天，形成致密的单层细胞模型。研究浓度、时间、温度、细胞旁路转运及跨膜转运蛋白（P-糖蛋白，多药耐药蛋白，乳腺癌耐药蛋白）在仙茅苷跨膜转运中的作用。结果：仙茅苷在Caco-2细胞模型中的跨膜转运存在一定的浓度及时间依赖性，细胞旁路转运不参与其转运，仙茅苷的外排转运存在一定的能量依赖性，且由P-gp参与。结论：仙茅苷在Caco-2细胞模型上主要以主动转运方式作跨膜转运，且P-gp参与其跨膜转运。
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LC-MS测定雷公藤甲素及其在Caco-2细胞上的转运特征
目的：建立体外模拟体内肠道细胞的Caco-2细胞Transwell模型，以此研究雷公藤甲素在Caco-2细胞模型上的跨膜转运特征。方法：采用聚酯碳酸酯膜连续培养Caco-2细胞21天，形成致密的单层细胞模型。然后对影响雷公藤甲素在Caco-2细胞模型上转运特征的因素包括浓度、时间及跨膜转运蛋白（P-糖蛋白，多药耐药蛋白，乳腺癌耐药蛋白）进行考察；同时采用LC-MS对溶液中的雷公藤甲素的含量进行测定。结果：雷公藤甲素主要以主动转运的方式进行吸收，且随着时间和药物浓度的增加，转运量明显增加。结论：雷公藤甲素在Caco-2细胞上转运存在一定的浓度及时间依赖性，且P-gp介导雷公藤甲素在Caco-2细胞上转运。
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Caco-2细胞模型在天然药物吸收研究中的应用
目的 Caco-2细胞模型为经典的口服药物体外吸收模型.此文介绍了Caco-2细胞模型的来源与特点,综述了Caco-2细胞模型在天然药物吸收研究中的应用现状,并对Caco-2细胞模型在天然药物研究中的应用前景进行了探讨.
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穿心莲内酯纳米混悬剂的制备及评价
目的 制备穿心莲内酯纳米混悬剂(ADG-NS),并对其进行表征和评价.方法 采用介质研磨法制备ADG-NS,对其粒径及分布、Zeta电位、粒子形态、结晶状态进行表征,采用体外溶出度试验和Caco-2细胞转运试验对ADG-NS进行初步评价.结果 ADG-NS的粒径、多分散性系数、Zeta电位分别为(215.6 ± 3.3) nm、0.165 ± 0.020和(-36.9 ± 2.8) mV.扫描电子显微镜(SEM)分析结果显示,粒子多呈棒状或块状,大小分布较均匀.差示扫描量热(DSC)和x射线粉末衍射(XRPD)分析结果显示,纳米混悬剂中的药物以无定型态存在.与原料药及穿心莲内酯滴丸比较,ADG-NS在不同pH值溶出介质中,溶出速率显著提高.Caco-2细胞单层细胞渗透试验表明,与原料药相比,ADG-NS显示较高的膜渗透性.结论 ADG-NS可以提高穿心莲内酯的体外溶出度与膜渗透性.
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LTD4及MK571对人结肠癌细胞SW480、Caco-2凋亡和增殖作用的体外研究
目的 观察半胱氨酰白三烯D4(LTD4)及半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂MK571对人结肠癌细胞株SW480、Caco-2增殖和凋亡的影响.方法 MTT法检测细胞生长活性;FITC Annexin V/碘化丙啶(PI)双染流式细胞术检测细胞的凋亡率;PI染色细胞,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 12.5 ～ 400 μg/L的LTD4对结肠癌SW480细胞有促增殖作用,且存在时效和量效依赖性;而1.6～12.5μg/L的LTD4处理24、48 h,对SW480细胞的增殖抑制作用无明显影响,作用时间延长至72 h,可促进SW480细胞的增殖.50～ 400 μg/L的LTD4对结肠癌Caco-2细胞有促增殖作用,且存在时效和量效依赖性;而1.6-50 μg/L的LTD4对结肠癌Caco-2细胞的影响与对照组相比差异无统计学意义.6.25～200 μmol/L的MK571对结肠癌SW480细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而0.8 ～ 6.25 μmol/L的MK571对SW480细胞的影响与对照组相比无明显差异.25～ 200 μmol/L的MK571对结肠癌Caco-2细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而0.8～ 25 μmol/L的MK571对结肠癌Caco-2细胞的影响与对照组相比差异无统计学意义.与阴性对照组相比,25 ～ 100 μg/L的LTD4对2种结肠癌SW480细胞和Caco-2细胞有促凋亡作用,且存在时效和量效依赖性;而100、200 μmol/L的MK571对2种结肠癌的凋亡无明显作用.与阴性对照组相比,25 ～ 100 μg/L的LTD4可以降低2种结肠癌细胞株G0/G1期比例,增加G2/M及S期比例;而100、200 μmol/L的MK571增加2种结肠癌细胞G0/G1期的比例,降低G2/M及S期比例.结论 LTD4具有促进人结肠癌SW480、Caco-2细胞株增殖的作用,该作用可能的作用机制是抑制凋亡、增加G2/M及S期细胞比例.MK571可抑制2种结肠癌细胞株的增殖,但对凋亡无明显影响,其抑制增殖作用的可能机制是阻滞细胞于G0/G1期.
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槲皮素改善TNF-α诱导的肠上皮Caco-2细胞功能障碍
为研究槲皮素改善TNF-α诱导的肠屏障功能障碍的细胞模型作用,实验采用TNF-α 200 ng/mL孵育Caco-2单层细胞24h构建上皮屏障功能障碍的模型,再采用槲皮素(5,15,30 μmol/L)干预模型,考察槲皮素对上皮单层细胞通透性及上皮的紧密连接(TJ)蛋白Claudin-1和Occludin蛋白功能及表达的影响.结果表明,与正常对照组比,TNF-α组的上皮通透性增强,屏障功能障碍,且TJ蛋白中的Claudin-1、Occludin的磷酸化成分减少.槲皮素干预模型细胞后浓度依赖地增强上皮屏障功能,上调Claudin-1、Occludin的磷酸化成分及Occludin的整体蛋白成分.提示槲皮素可通过加强紧密连接蛋白的结构和功能改善肠上皮屏障功能.
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靛玉红磷脂复合物的跨膜转运及其犬体内药代动力学
目的:考察靛玉红磷脂复合物的跨膜转运及其在Beagle犬体内药代动力学过程.方法;采用HPLC法测定靛玉红的浓度;通过缚管翻转肠囊实验、离体肠黏膜透过实验、Caco-2细胞透过实验考察靛玉红片及其磷脂复合物的跨膜转运作用;同时,考察靛玉红磷脂复合物在Beagle犬体内的药代动力学.结果:靛玉红磷脂复合物的转运速度和表观渗透系数均明显高于靛玉红,具有显著性差异(P《0.05);以靛玉红市售片为对照,靛玉红磷脂复合物在犬体内的相对生物利用度为(157.06±10.04)%.结论:磷脂复合物可以促进靛玉红的跨膜转运,并可提高其口服生物利用度.
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壳聚糖及其衍生物包覆的脂质体对胰岛素细胞旁路转运的促进作用
目的:考察壳聚糖及其衍生物包覆的脂质体对胰岛素细胞旁路转运的促进作用.方法:采用逆相蒸发法制备胰岛素脂质体;利用离体肠黏膜法和Caco-2细胞模型法研究壳聚糖及其衍生物包覆的胰岛素脂质体的肠吸收;分别运用放射免疫法和HPLC法测定离体肠黏膜法和Caco-2细胞模型法接收池中胰岛素含量.结果:胰岛素跨肠黏膜转运能力大小次序为:CH-CEC组＞CH组＞TMC组＞CEC组＞Uncoated组＞Ins组;胰岛素跨Caco-2细胞单层膜的转运能力大小次序为:CH组＞CH-CEC组＞CEC组＞TMC组＞Uncoated组＞Ins组.结论:脂质体能增加胰岛素的跨膜转运,而脂质体经壳聚糖及其衍生物包覆后通过打开上皮细胞紧密结,进一步提高胰岛素经细胞旁路的转运能力.
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盐酸度洛西汀对Caco-2细胞P-糖蛋白功能及表达的影响
目的 研究盐酸度洛西汀(DLX)对Caco-2细胞上P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响.方法 将Caco-2细胞分为阴性对照组、维拉帕米10 μmol/L阳性对照组(VER组)和DLX 0.2、5、10 μmol/L不同浓度处理组.采用流式细胞术检测DLX干预后Caco-2细胞内罗丹明-123的荧光强度和细胞膜上P-gP的表达量.结果 与阴性对照组相比,DLX 0.2、5、10 μmol/L均显著抑制罗丹明-123从Caco-2细胞的外排(96.3±4.5 vs.129.5±14.5、131.2±7.0、135.6±17.1)(P＜0.05),而对P-gp阳性率无明显改变(90％ vs.94％、91％、89％)(P＞0.05).结论 DLX能抑制Caco-2细胞上P-gp的功能,降低罗丹明-123从Caco-2细胞中的外排,但并不影响P-gp的表达.
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大黄素对肠上皮细胞损伤的保护作用及机制研究
目的 观察缺氧/复氧( hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤条件下大黄素(Emodin)对肠上皮细胞表达紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的影响,以研究大黄素对肠黏膜屏障的保护作用机制.方法 体外培养肠上皮细胞株Caco-2建立H/R模型,将细胞随机分为正常细胞(N)组、缺氧复氧(H/R)组、缺氧复氧+ Hank平衡盐溶液(H/R+ HBSS)组、缺氧复氧+大黄素(H/R+ EN)组.检测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值；使用透射电子显微镜观察紧密连接的变化；用Western blot法测定Occludin和ZO-1蛋白的表达水平；半定量RT-PCR法测定Occludin和ZO-1的mRNA表达水平.结果 与H/R组、H/R+ HBSS组相比,H/R+ EN组的紧密连接破坏明显减少；H/R+ EN组的TEER值、Occludin和ZO-1的蛋白及mRNA表达水平明显高于H/R组、H/R+ HBSS组(P＜0.05).结论 大黄素可通过减少Occludin、ZO-1的破坏并增加其表达来保护肠黏膜屏障.
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黄芪多糖对Caco-2细胞P-gp功能、表达的影响
目的：观察黄芪多糖（APS）对Caco-2细胞P糖蛋白（P-gp）功能、表达的影响。方法采用MTT法考察药物对细胞的毒性,确定药物大无毒浓度；流式细胞仪测定Caco-2细胞P-gp底物罗丹明-123（Rh-123）和抗体的荧光强度，评价APS对P-gp功能和表达的影响；建立Caco-2细胞单层模型，观察APS对Rh-123跨膜转运的影响。结果细胞毒性实验结果显示，APS在0.1~100μg/mL浓度范围内对Caco-2细胞无明显毒性，细胞存活率跃90%；不同浓度的APS作用后，增加细胞内Rh-123的蓄积，对P-gp功能表现为抑制作用；中、高浓度50、100μg/mL的APS对P-gp表达有抑制作用[（26.72±2.43）、（23.97±2.08）比（30.10±1.28），P<0.05]，其表达量分别降低11.23%和16.41%；高浓度APS 100μg/mL明显抑制Rh-123的双向跨膜转运，对P-gp有抑制作用。结论黄芪多糖（APS）对P-gp的功能和表达有一定的抑制作用，且在高浓度尤为明显，能显著增加Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积，并抑制其双向跨膜转运。
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结肠癌Caco-2细胞株与患者药靶蛋白表达的一致性研究
目的 对结肠癌细胞株与患者组织间的药物靶点蛋白表达进行一致性研究,以明确两者的相符性.方法 检索Human Protein Atlas数据库中FDA批准的药物靶点蛋白,并对兼有患者结肠癌组织和细胞株数据的蛋白进行表达评分.通过计算蛋白在细胞株与患者间表达的一致率,总体评价两者蛋白表达的相符情况,继而采用生物信息学方法进行蛋白生物学功能和信号通路注释,评价个体患者与细胞株间蛋白表达的差异性.结果 共检索得兼有细胞株(均为Caco-2细胞)和患者表达数据的药物靶点蛋白176个.患者与细胞株表达一致的蛋白比率为57.4％,与患者年龄、性别、肿瘤部位等均无相关性.两者间表达一致性较高或较低的蛋白数分别为69和82,其中47和36个蛋白表达完全一致或完全不一致.不一致蛋白在恶性肿瘤相关通路、免疫相关通路、胞外基质受体相互作用、细胞骨架与形态相关通路的富集更为显著.结论 药物靶点蛋白在Caco-2细胞株与患者结肠癌组织间的表达存在一定的差异性,提示考察细胞株与患者间靶蛋白表达的一致性具有重要意义.
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黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞毒性研究
目的 研究黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞的毒性.方法 75％乙醇回流提取得黄药子提取物,高、中、低剂量作用于Caco-2细胞,以黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用于HL-7702和HepG2细胞,进行细胞活性实验,测定生化指标ALT、AST、GSH-PX和MDA值.结果 与对照组比,高剂量组和中剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用后,HL-7702和HepG2细胞的存活率显著降低(P＜0.01)；高剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用72 h后,HL-7702细胞上清液中ALT、AST显著升高(P＜0.01)；高剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用48 h和72 h后,HepG2细胞上清液中ALT、AST显著升高(P＜0.01).高剂量组和中剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用48 h和72 h后,HL-7702和HepG2细胞上清液中MDA显著升高,GSH-PX显著降低(P＜0.01).结论 黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞有毒性.
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从极性原子净电荷预测药物在人体小肠中的吸收
目的:从极性原子净电荷预测药物在人体小肠中的吸收百分数和透过Caco-2单细胞层的渗透系数.方法:用分子力学MM+法得到药物分子的优化几何构型,用Monte Carlo法计算分子体积,用半经验自洽场分子轨道CNDO/2法计算原子净电荷,相关分析采用逐步多元回归分析法.结果:药物分子在人体小肠中的吸收百分数和透过Caco-2单细胞层的渗透系数,均与氢键给体的原子净电荷之和(∑QH)与氢键受体的原子净电荷之和(∑QN,O)具有良好的相关性.氢键给体的正电荷和氢键受体的负电荷越多,药物分子在人体小肠中的吸收百分数和透过Caco-2单细胞层的渗透系数就越小.结论:药物在人体小肠中的吸收与其形成氢键能力密切相关.形成氢键能力弱的药物分子在人体小肠中的吸收较大.从极性原子净电荷参数预测药物在人体小肠中的吸收,具有方便快捷的优点,可用于候选口服药物的高通量筛选.
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tBHQ和Sulforaphane对Caco2细胞Nrf2-ARE信号通路的影响
目的:研究抗氧化性诱导剂(激活剂)叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)和莱菔硫烷[1-异硫氰酸-(4R,S)-(甲基亚磺酰基)丁烷](sulforaphane,SFN)对人结肠癌细胞株Caco2的Nrf2-ARE信号通路的影响.方法:选取不同的时间点,分别用20 μmol/L tBHQ和5 μmol/L SFN处理Caco2细胞,从蛋白质水平、mRNA水平和蛋白质定位3个方面,分别用Western blotting、real-time PCR和免疫荧光染色(immunoflourescence staining,IF)方法来检测Nrf2以及其调控基因AKR1C1和NQO1(Western blotting,real-time PCR)表达的变化.结果:细胞核中Nrf2基因表达的佳时间点为加药诱导后8 h,细胞质中Nrf2调控基因AKR1C1和NQO1表达的佳时间点为加药诱导后16 h.tBHQ的诱导作用在撤去之后仍能持续4 h.结论:本研究使用激活剂tBHQ和SFN对Caco2细胞的Nrf2-ARE信号通路进行诱导,取得了佳的诱导时间点,并研究了撤去tBHQ后持续诱导时间,为今后在肿瘤化学预防研究中,筛选合适的激活剂及其剂量和使用次数提供了重要依据,也为研究Nrf2-ARE信号通路的抑制剂提供了重要信息.
