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hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析
目的 构建含限制性内切酶位点Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体，比较分析序列的变化，为以后的毒理学研究提供实验材料。方法 从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RTPCR扩增，直接与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，用蓝/白斑试验筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，再行序列分析。结果 经RT-PCR获得631 bp含限制性内切酶位点的阳性产物，T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实，克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99.5％。结论 本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆，该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。
关键词： hMSH2 RT-PCR T载体 序列分析 -
hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆
目的克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料.方法采用RT-PCR方法,用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增hPARP-1基因片段,并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果经RT-PCR获得507 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99.9%.结论该实验成功地构建了含hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆,为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具.
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大鼠脑源性神经营养因子基因T载体的构建及鉴定
目的:探讨利用T载体完成大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物克隆的可行性.方法:提取大鼠脑组织总RNA,利用M-MLV逆转录酶及oligo-dT引物逆转录合成cDNA第一条链,再利用exTaq酶及BDNF上、下游引物扩增出BDNF cDNA,后利用Buffer Ⅰ连接液将BDNF基因克隆入T载体用于测序及下一步克隆.结果:成功构建了BDNF基因T载体,经双脱氧链终止法测序证实为大鼠BDNF基因.结论:利用T载体克隆BDNF基因PCR产物简便、快捷,成功率高.
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一种高效T载体的构建及其对人端锚聚合酶HPS结构域的克隆
目的:制备一种高效T载体,并检测其克隆PCR产物的效率.方法:构建质粒pGH-T,它包含2个Xcm Ⅰ酶切位点,并在两位点间插入一段约600 bp的DNA序列.用Xcm Ⅰ彻底消化质粒pGH-T后,回收线性化大片段,即得T载体.利用此T载体克隆人端锚聚合酶(tankyrase)HPS结构域的PCR产物,并用限制酶切鉴定克隆的结果.结果:自制T载体可高效克隆PCR产物,其效率可达80%～100%.结论:自制T载体对PCR产物的克隆效率与商品完全相同,但使用方便且价格低廉.
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丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析
目的 构建含丙型肝炎病毒(HCV)核糖体插入位点(IRES)序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料.方法 以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列.将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果 经PCR获得355bp含限制性內切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%.结论 该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆.
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Adr亚型HBV中蛋白基因的T载体克隆及序列分析
构建含适当限制酶切位点的adr亚型乙肝病毒(HBV)中蛋白基因克隆,比较分析序列变化,用作HBV疫苗表达及诊断试剂的研究.患者血清经蛋白酶K消化,再以酚-氯仿抽提,对提取物进行PCR扩增.回收PCR阳性产物,经琼脂糖酶消化后直接克隆至T载体.转化后提取质粒经PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:10份血清提取物的PCR有3份获阳性产物,分别经T载体克隆后转化DH10b菌,3株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于adr亚型,与国内已发表序列的同源性大于99.6%.提示该克隆是用作HBsAg蛋白表达或探针标记研究的理想克隆.
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基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化
目的:构建基于XcmI识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化.方法:首先将5'和3'端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 cDNA定向克隆至pCDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于pCDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和dATP处理,分别将长度为312 bp和1 329bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率.结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和dATP处理也能够显著增加连接效率.结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索.
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聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因
目的 利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证.方法 收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TRIzol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证.结果 总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因.测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源.结论 该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础.
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人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆
目的克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因.方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA,构建PMD18-T载体,采用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果RT-PCR扩增长度为968 bp的基因片段,BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段,测序结果显示编码区无基因突变.结论人FS全长cDNA基因克隆成功,并构建了重组PMD18-T载体.
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T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆
目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf (+)经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.
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利用XcmⅠ构建T载体
目的:构建能自我复制的T载体.方法:设计一对引物,引入XcmⅠ酶切位点,通过PCR方法用PET-28(a)+作模板扩增550bp,插入Pa载体后用限制性内切酶、PCR及DNA测序等方法作鉴定.结果:用XcmⅠ酶切可见540bp及3810bp双酶切条带,用此载体作模板可扩增出550bp片段,测序结果与预期序列一致.结论:带有两个XcmⅠ位点的环状载体被成功构建.
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神经生长因子高亲和力受体 (Trk A) cDNA片段的克隆
目的:克隆大鼠背根神经节中NGF高亲和力受体基因.方法:从出生1周大鼠背根神经节中抽提总RNA,设计TrkA引物,进行RT-PCR扩增.扩增产物直接与T载体连接后转化E. coli DH5α,用蓝/白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析.结果:经RT-PCR获得预期416bp的目的片段,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与Genbank中TrkA基因序列100%同源.结论:成功地构建了含Trk A基因cDNA的T载体克隆,该克隆可在一定侧面有助于在分子水平研究某些金属中毒导致的神经损伤.
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单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因克隆与序列分析
目的 克隆单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因并进行序列比较分析.方法 分别从参考菌株CCTCCAB97021和分离菌株XFL0605中PCR扩增mpl全基因,连接到T克隆载体转化到受体菌DH5α中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定,分别获得阳性克隆转化子后测序,运用DNAStar软件对测定核苷酸及推导AA序列与GenBank中李斯特菌属的部分菌株进行分析.结果 成功克隆了单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因,所获得的mpl基因片段具有完整的ORF,均全长1 533bp,编码510个氨基酸.对李斯特菌属mpl基因遗传性分析显示L. monocytogenes与L. seeligeri和L. ivanovii处于不同的分支,在L. monocytogenes种内分为两个群,表明mpl能够反应出这三种李斯特菌株的亲缘关系.结论 单核细胞增多性李斯特菌mpl基因具有种的特异性.
关键词： 单核细胞增多性李斯特菌 金属蛋白酶 MPL基因 T载体 -
T载体的构建及在恶性疟原虫RAP2基因克隆中的应用研究
目的构建PCR产物高效克隆载体T载体,并应用于克隆恶性疟原虫RAP2基因.方法 PUC18用SmaI酶切纯化后,与dTTP在70℃孵育3h,构建 T载体.另设计一对特异引物,采用PCR方法从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DN A中特异扩增RAP2基因,并将其克隆入T载体,重组克隆经蓝白斑初筛后,再用双酶切及PCR法进行鉴定.结果从恶性疟原虫基因组DNA中特异扩增出大小为1215bp基因片段,与预期长度相符.克隆入T载体后的重组克隆经双酶切及PCR鉴定均正确无误.结论成功构建T载体,并获得阳性重组克隆T-RAP2,为进行该R AP2基因的序列测定及研究该基因的结构与功能奠定基础.
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人PPARγ1受体cDNA全长序列的克隆及测序
目的 对人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(hPPARγ1)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARγ1基因真核表达载体奠定基础.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARγ1全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用Xhol、SmaI双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMDl9-hPPARγ1-T载体中hPPARγ1基因的完整性和忠实性.结果 经酶切和测序证实,pMDl9-hPPARγ1-T载体中插入的hPPARγ1基因序列与GeneBank中提交的序列一致.结论 成功克隆了hPPARγ1基因,构建了pMDl9-hPPARγ1-T中间载体.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ cDNA克隆 T载体 测序 -
反义乙型肝炎病毒S基因T载体克隆的构建
目的:构建含部分乙型肝炎病毒(HBV)S基因反义序列的基因克隆.方法:根据GenBank中HBV S基因序列和计算机软件mCLONE分析的结果,设计S基因2侧引物,直接扩增出适合长度的反义HBV S基因,与PMD18T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:获得226 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆经PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段的反向序列与GenBank中该基因的序列同源性为97%.结论:成功构建了含反义HBV S基因部分序列的T载体克隆.
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黑色素瘤抗原-1基因并进行序列分析
目的:克隆黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因并进行序列分析.方法:从人肝细胞性肝癌(HCC)组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出MAGE-1基因,酶切鉴定后将其插入pGEM-T easy载体,对其进行序列测定并与GenBank中已知序列进行同源性分析.结果:所克隆的MAGE-1基因与GenBank 中的MAGE-1基因序列相比较,仅有4个碱基存在差异,同源性为99.7%,而且仅有1处碱基差异引起了氨基酸改变.结论:从人HCC组织中成功克隆了MAGE-1基因.
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唾液富组蛋白5克隆载体的构建
目的 将唾液富组蛋白5(histatin5)的cDNA克隆至T载体,获取大量酶切后的目的 片段.方法 选用大肠杆菌偏爱密码子编码histatin 5氨基酸,设计5'端带酶切位点、3'端互补的两条引物,通过overlap PCR获取histatin 5的cDNA,将cDNA与T载体连接后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,PCR、酶切、测序鉴定.酶切重组T载体,获取目的 片段.结果 Histatin 5的cDNA正确克隆至T载体,无突变.结论 克隆载体构建成功,有利于目的 片段的酶切和回收.
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细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-hSDF-1α腺病毒质粒
目的:利用细菌内同源重组法构建和制备含人基质细胞源衍生因子-1α(hSDF-1α)重组腺病毒质粒. 方法:设计5' 端分别具有EcoR V/Xho Ⅰ酶切位点的扩增hSDF-1α cDNA片段上下游引物,聚合酶链反应法(PCR)从pORF-hSDF-1α质粒中扩增hSDF-1α的cDNA,插入pGEM-T Easy 载体中,构建pGEM-T-hSDF-1α质粒,EcoR V/Xho Ⅰ双酶切后回收279 bp片段,与经过相同酶切的8.8 kb pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,连接产物转化感受态DH5 α,挑选克隆,重组质粒pShuttle-EGFP-hSDF-1α用EcoR V/ Xho Ⅰ酶切鉴定.pShuttle-EGFP-hSDF-1α经Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α; pAd-EGFP-hSDF-1α质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定.结果:线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183, 重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了279 bp的片段.结论:用细菌内同源重组成功地构建了含hSDF-1α cDNA的重组腺病毒质粒,为进行表达hSDF-1α的重组腺病毒的制备及hSDF-1α在骨髓源干细胞动员迁移中的作用研究奠定了基础.
关键词： 同源重组 T载体 人基质细胞源衍生因子-1 腺病毒 增强型绿色荧光蛋白 -
巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体
目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体.方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5a,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析.结果重组质粒PCR扩增得到1568的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%.结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法,可用于基因的检测和载体的构建.
关键词： 巢式-PCR 细胞色素P450基因 T载体 测序分析
