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基于原代海马神经元的神经毒性物质高内涵筛选方法的研究
目的 建立基于原代海马神经元模型的神经毒性物质高通量筛选方法,并对该方法进行评价.方法 应用高内涵筛选技术定量检测11种药物对原代海马神经元的细胞数量、线粒体质量、MnSOD水平、γH2AX水平和神经突起生长等参数的影响.结果 安眠酮、多虑平、地西泮、氯苯那敏和氯氮平等在抑制细胞存活的同时,引起线粒体质量改变,MnSOD水平、γH2AX水平升高,细胞突起变短;艾司唑仑使线粒体质量下降,抑制细胞突起生长;苯巴比妥促进细胞神经突起生长;阿司匹林引起线粒体质量下降;麻黄碱引起γH2AX水平升高.结论 与文献已有数据进行比较,神经毒性检测正确率高,可为进一步的神经毒性评价及神经机制研究提供参考.
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高内涵筛选技术应用于药物毒理方面的研究进展
高内涵筛选技术（HCS）是基于高效新药筛选需求发展起来的一项新技术，基于活细胞、多参数、低成本、高通量及高灵敏度优点，能够快速实现对化合物多种生物活性及毒性的早期快速检测，并且对药物毒理机制研究提供帮助，是药物细胞毒理学研究优秀的技术手段。目前，HCS 已用于多种靶器官细胞毒性、遗传毒性、神经毒性等的检测以及毒理学分子机制的研究。
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一种药物注射剂类过敏反应高内涵检测方法的初步建立
类过敏反应是药物注射剂常见的不良反应,但现有检测方法尚存在诸多不足.该研究采用荧光标记和高内涵筛选技术建立了一种类过敏反应体外检测方法,应用RBL-2H3细胞脱颗粒模型,以细胞膜特异荧光染料FM4-64标记细胞脱颗粒囊泡回收来确定阳性细胞数,以细胞核特异荧光染料Hochest 3334标记细胞核来确定细胞总数,从而计算药物刺激后的细胞脱颗粒率.为了考察高内涵检测方法可靠性,首先采用阳性药物Compound 48/80验证了高内涵检测方法与传统过敏介质β-氨基己糖苷酶释放和小鼠耳廓皮肤蓝染检测方法间一致性,结果显示高内涵检测方法与传统检测方法高度一致,且灵敏度高于传统检测方法;然后采用30批次临床报告过敏症状丹红注射液进一步验证高内涵检测方法的可靠性,结果提示高内涵检测结果与临床报告高度一致,而且高内涵方法一定程度上能够克服注射液自身颜色干扰问题.可见,类过敏反应高内涵检测方法是一种灵敏、可靠、简便且可实现高通量筛选的新方法,适用于药物注射剂类过敏反应评价,能够为临床安全用药提供指导.
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基于微流控芯片技术的天然产物活性成分筛选的研究
随着药物筛选技术的不断发展,新的筛选途径和技术不断涌现,使得药物筛选朝着快速、高效、高通量等方面不断发展.微流控分析技术具有的分析微型化、高通量化、可集成化和良好的生物相容性等特点,为天然产物活性成分的筛选提供了新的方法和技术平台,该文介绍了用于天然产物活性成分的多种筛选方法,重点综述了与细胞培养相结合的微流控芯片筛选技术及其特点,微流控芯片筛选技术平台的构成,以及其在天然产物活性成分筛选中的应用.
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应用高内涵技术研究桂枝茯苓胶囊抗炎及免疫调节活性成分
该文旨在研究桂枝茯苓胶囊中17个成分的抗炎与免疫调节活性.主要选择LPS刺激的RAW264.7细胞为炎症模型,考察17个成分的体外抗炎作用,ELISA法检测IL-1β,TNF-α,PGE2释放水平、免疫荧光法检测COX-2表达水平;选择脾脏淋巴细胞体外活化增殖为模型,考察17个成分的免疫调节活性,MTT法和Hoechst 33342染色法检测细胞增殖水平.结果显示,在LPS诱导RAW264.7释放炎症因子模型上筛选出10个活性较强成分;在脾脏淋巴细胞活化增殖模型上筛选出10个活性较强成分.剔除重复成分,在上述2个模型上共计筛选出强活性成分15个.以上结果表明,这15个成分可能是桂枝茯苓胶囊抗炎、调节免疫,治疗相关疾病如盆腔炎等的主要活性成分.
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艾司唑仑对中枢神经系统影响的评价方法研究
目的 探讨基于随机双盲交叉试验的心理认知测试和基于细胞模型的高内涵筛选方法在药物航空安全性评价中的应用.方法 随机双盲交叉试验后测试艾司唑仑对志愿者心理认知的影响,应用高内涵筛选技术定量检测艾司唑仑对PC12和大鼠海马神经元细胞多参数的影响.结果 飞行心理品质5个项目和基本认知能力1个项目的得分,安慰剂组显著优于艾司唑仑组.艾司唑仑在300 ～ 1000 μmol/L使PC12细胞的数量、面积以及宽度均减少,使海马神经元的线粒体质量减少;在1000 μmol/L时,使PC12细胞的圆度和γH2AX荧光强度增加、线粒体质量减小.结论 基于随机双盲交叉试验的心理认知测试灵敏准确,可作为药物评价的确认方法;而基于细胞的高内涵神经毒性筛选低成本、无损伤、高通量,具有成为药物初筛方法的潜力.
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基于高内涵分析的山药增强巨噬细胞吞噬活性及质量评价研究
目的 比较铁棍山药与非铁棍山药促进巨噬细胞吞噬活性的差异.方法 采用CCK-8法,考察不同山药在不同浓度下的细胞毒性;在无毒剂量的基础上,建立高内涵结合荧光标记技术检测RAW264.7细胞吞噬GFP-E.coli细菌的体外生物模型,计算不同山药在不同浓度下的细胞吞噬率;采用“质反应平行线法”将测定的细胞吞噬率转化为生物效价,更好地检测铁棍山药与其他山药生物效价的区别.结果 在0.695 ～ 5.56 mg(生药)·mL-1内,11个批次的山药样品都不存在细胞毒性;高内涵分析细胞吞噬强度结果显示,在此浓度范围内,各种山药都能促进细胞吞噬率的增高;高内涵图像能够清晰地显示出RAW264.7细胞吞噬绿色荧光蛋白标记细菌的情况.生物效价结果显示,不同批次山药的免疫生物效价介于39.56～100 U·mg-之间,以铁棍山药的生物效价为高,且平均效价值明显高于非铁棍山药(P＜0.05).结论 体外实验表明,铁棍山药及非铁棍山药都能不同程度地促进RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性;且铁棍山药的生物效价明显高于非铁棍山药,这与普遍认为的“铁棍山药质量佳”也相符.
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基因编码钙指示剂在药物反应性细胞核钙信号实时动态检测中的应用
目的 探讨新型基因编码钙指示剂(genetically-encoded calcium indicators, GeCIs)在药物反应性细胞核钙信号实时动态检测中的应用.方法 将常用的GeCI变体--GCaMP6s用核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)标记以用于细胞核钙的检测;同时在其C端与红色荧光蛋白tdTomato融合作为分子内的定量参照.将构建的质粒分别转染至HeLa细胞和U87MG细胞中,利用活细胞共聚焦显微成像技术对核钙信号的实时变化进行动态监测.结果 蕈青霉素(Paxilline)能够引起在40 min连续记录中核钙水平的持续增加,并且增加的动力学模式在不同的细胞系中差异存在统计学意义;同时在药物处理后细胞反应的筛选中显示,青蒿素可以引起细胞核钙浓度的明显改变,其变化的幅度与持续情况与蕈青霉素及过氧化氢的作用有所不同.此外,笔者还发现利用核钙的变化指标可以对细胞在接受应激性刺激后的异质性表现进行统计聚类分析.结论 在非兴奋细胞中,不同药物刺激可以引起细胞核钙离子浓度的升高.
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高内涵筛选与流式细胞分析技术在心肌成纤维细胞增殖研究中的应用
心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖参与了心脏疾病的病理生理过程并发挥重要作用.本文旨在应用高内涵筛选(high-content screening,HCS)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析评价CFs增殖,以期建立精确定量评价细胞增殖和细胞周期的方法.采用酶消化法分离C57BL/6J新生乳小鼠(出生24～48 h)CFs,盘状结构域受体(discoidin domain receptor 2,DDR2)染色显示分离后培养的CFs纯度＞95％.CFs经血清饥饿12h后给予10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)处理24 h,进行溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)和二脒基苯基吲哚(diamidino-phenylindole,DAPI)原位染色或BrdU和7-氨基放线菌素D (7-Aminoactinomycin D,7-AAD)单细胞悬液染色,分别利用HCS或FCM检测CFs增殖和细胞周期.结果表明:(1) HCS分析显示,10％ FBS诱导组BrdU阳性细胞比例与无血清对照组比较有显著性差异[(12.96±0.67)％ vs (2.77±0.33)％;P＜0.05];细胞周期分析显示,细胞处于G0/G1期DNA为二倍体(2N),进入S期DNA复制,G2期DNA倍增(4N),到M期DNA平分到两个子细胞核中(2N).(2) FCM分析显示,10％ FBS诱导组BrdU阳性细胞比例比无血清对照组明显增大,差异显著[(11.10±0.42)％ vs (2.22±0.31)％; P＜ 0.05]; DNA含量直方图细胞周期分析显示,10％ FBS诱导组S期平台比对照组明显抬高.(3)对比分析HCS和FCM检测结果,BrdU阳性比例以及G0/G1、S、G2/M期细胞百分比等各项指标均无统计学差异.证实HCS和FCM两种技术能够应用于定量分析CFs增殖和细胞周期,方法实用可靠,结果一致.
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正交设计优选丹参-人参活性组分抗乳腺癌有效配伍
目的：优选丹参-人参活性组分抗乳腺癌的佳配伍，初步研究其作用机制。方法采用正交设计，以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，人乳腺正常上皮细胞MCF-10A作为对照，应用CCK-8法，以细胞生长抑制率为指标优选丹参-人参活性组分的佳配伍；结合实时细胞分析技术验证佳配伍对细胞的增殖抑制作用；采用高内涵细胞分析技术检测佳配伍对细胞凋亡的影响。结果优选出丹参-人参抗乳腺癌的佳配伍为：丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖，其配比是5、10、5 mg·L-1；实时细胞分析技术检测结果表明，佳配伍对乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制作用明显，对正常乳腺细胞MCF-10A的增殖抑制作用不明显；高内涵荧光细胞分析检测佳配伍的Hoechst、Annexin V、PI染色荧光，与对照组相比，诱导凋亡作用对于MCF-7细胞差异有显著性(P<0．01)，对于MCF-10A细胞差异无显著性(P>0．05)。结论丹参-人参活性组分的佳配伍对乳腺癌MCF-7细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用，而对正常乳腺MCF-10A细胞无明显影响，具有选择性抗MCF-7乳腺癌的作用。
