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环磷酰胺与异环磷酰胺对离体大鼠肝细胞毒性机制
目的探讨环磷酰胺(CP)与异环磷酰胺(Ifo)对混悬培养大鼠肝细胞的毒性效应及其可能机制.方法以两步灌流法消化成年大鼠肝细胞,并进行混悬培养.CP与Ifo分别以20 mmol/L染毒,观察染毒后30、60、120和180 min肝细胞的存活率、胞内酶泄漏以及肝细胞巯基、MDA含量的变化,并对肝细胞表面形态和超微结构进行观察.结果随着染毒时间的延长,两药均引起肝细胞存活率逐渐下降,胞内酶泄漏加重,培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转移酶(AST)活性增高,同时肝细胞总巯基(TSH)、非蛋白巯基(NPSH)、蛋白巯基(PSH)也逐渐下降,其中PSH下降在TSH耗竭中起主要作用.两药引起的这些改变CP有比Ifo重的趋势.肝细胞MDA含量未发现有显著增高.形态学检查发现CP与Ifo 20 mmol/L染毒180 min均使肝细胞表面出现"大疱”,胞内线粒体肿胀,空泡化,粗面内质网扩张,部分脱颗粒,内腔模糊.结论 CP与Ifo对混悬培养大鼠肝细胞有损伤作用,巯基物质的降低在两药肝细胞毒性中起重要作用.
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2-11 环磷酰胺与异环磷酰胺对大鼠肝细胞的毒作用
目的探讨环磷酰胺(CP)与异环磷酰胺(Ifo)对混悬培养大鼠肝细胞的毒性效应及其可能机制.方法以两步灌流法消化成年大鼠肝细胞,并进行混悬培养.CP与Ifo分别以20mmol染毒,观察染毒后30、60、120和180 min肝细胞的存活率、胞内酶泄漏情况以及肝细胞巯基状态、丙二醛(MDA)含量的变化,并对肝细胞表面形态和超微结构进行观察.结果随着染毒时间的延长,两药均引起肝细胞存活率逐渐下降,胞内酶泄漏加重,培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性逐渐增高,同时肝细胞总巯基(TSH)、非蛋白巯基(NPSH)、蛋白巯基(PSH)逐渐下降,其中PSH下降在TSH耗竭中起主要作用.两药引起的这些改变CP有比Ifo重的趋势.两药染毒期间肝细胞MDA含量均未发现有显著增高.形态学检查发现CP与Ifo 20mmol染毒180 min均使肝细胞表面出现"大疱”,胞内线粒体肿胀,空泡化,粗面内质网扩张,部分脱颗粒,内腔模糊.结论 CP与Ifo对混悬培养大鼠肝细胞有损伤作用,巯基物质的降低在两药肝细胞毒性中起重要作用.
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镉诱导HL-7702细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3的表达
镉是一种有毒的重金属元素,易在体内蓄积,镉对机体毒性效应十分复杂.肝脏是镉损伤的主要靶器官之一,目前对镉致肝细胞损伤机制尚不十分清楚.镉可诱导多种细胞发生凋亡,如大鼠肝细胞、人肝癌细胞株和原代培养的鼠肺上皮细胞等[1-6].
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京尼平苷酸对siRNA介导BRL-3A细胞中FXR基因沉默后MRP2和BSEP表达的影响
目的:通过siRNA干扰法尼酯衍生物X受体(FXR)基因沉默与否考察京尼平苷酸(GPA)对BRL-3A细胞中多药耐药相关蛋白2(MRP2)和胆汁酸转运体胆盐输出泵(BSEP)的影响.方法:运用RT-PCR检测siRNA介导FXR沉默结果和GPA对BRL-3A细胞中FXR、MRP2和BSEP基因水平的影响;Western blot检测FXR被沉默后、以及GPA对BRL-3A细胞中FXR沉默与否,对FXR、MRP2和BSEP蛋白水平的影响.结果:4mmol/L和1mmol/L浓度的GPA可以上调BRL-3A细胞中FXR、MRP2和BSEP基因和蛋白的表达水平,且与GPA的剂量呈正相关,在统计学上有显著性差异(P＜0.01,P＜O.05);4mmol/L和lmmol/L浓度的GPA可以逆转因siRNA-FXR沉默引起的FXR、MRP2和BSEP基因和蛋白水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05),且以GPA呈剂量正相关.结论:FXR的沉默可下调胆汁酸转运体MRP2和BSEP基因和蛋白的表达,GPA在体外可通过上调FXR来上调MRP2和BSEP基因和蛋白的水平.
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维生素E对培养的肝细胞和储脂细胞细胞外基质的影响
1989年,Chojkier和Igarashi分别报告脂质过氧化可发生在未受刺激、静止的培养成纤维细胞和活体正常组织.本实验旨在了解体外培养大鼠肝细胞和储脂细胞(Ito细胞)是否存在过氧化脂质和前胶原基因表达的产物,正常培养大鼠Ito细胞有无其它细胞外基质的产生,维生素E(VE)能否抑制基础脂质过氧化和细胞外基质(ECM)产生.
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罗格列酮抑制CsA引起的大鼠肝细胞TGF-β1和FIBRONECTIN的表达
本实验拟用罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)干预环孢素A(cyclosporine A,CsA)刺激下的大鼠肝细胞,观察其过氧化物酶体增殖受体γ(peroxisome proliferator-activated receptory,PPARγ)、转化生长因子131(transforming growth factor β1,TGF-β1)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的表达,探讨RGZ对CsA肝毒性的改善作用.
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去卵巢大鼠肝细胞脂类蓄积的实验研究
成熟雌性大鼠切除双侧卵巢后,体内雌激素水平下降,可模拟更年期疾病的许多病理改变, 如生殖器官萎缩、骨质疏松、脂类代谢紊乱等,但尚未见到国内外关于切除卵巢后肝脏脂类代谢及组织学实验研究的报道.
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泡球蚴囊液对原代培养大鼠肝细胞增殖影响的初步研究
目的 探讨泡球蚴囊液对体外原代培养大鼠肝脏细胞增殖的影响. 方法 以Wistar大鼠作肝细胞供者,采用胶原酶肝脏原位灌流消化法分离肝细胞.取1×106肝细胞接种于Ⅰ型胶原铺底35 mm培养皿,无血清培养20 h后以泡球蚴囊液置换培养液培养24 h和48 h,期间在荧光倒置显微镜下观察肝细胞形态变化,流式细胞仪测定细胞周期;另取1×105肝细胞接种于Ⅰ型胶原铺底96孔培养板,同上培养,MTT法检测泡球蚴囊液对大鼠肝脏细胞毒性作用. 结果 与泡球蚴囊液共培养后肝细胞贴壁生长良好,MTT法测定肝细胞存活率为77.5%～100%.培养24 h后肝细胞增殖指数(PI)泡球蚴囊液处理组为(49.35±4.00)%,对照组为(82.00±6.00)%;培养48 h后两组肝细胞增殖指数(PI)分别为(27.61±6.00)%和(67.00±10.00)%,差异均有显著性(P＜0.05). 结论 泡球蚴囊液对体外培养大鼠肝细胞无毒害作用,但对肝细胞的增殖有一定的抑制作用.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养时的肝细胞功能
目的:利用原代培养的大鼠肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,研究骨髓间质干细胞对肝细胞功能的影响,以便更好用于肝细胞移植及生物人工肝.方法:采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离大鼠旰细胞,获得有活性生的肝细胞进行原代培养.台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活性;光镜下动态观察细胞形态学改变,并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能.比较肝细胞单纯培养及其与骨髓间质干细胞共同培养时细胞的功能.结果:培养7 d时两组均仍然维持白蛋白分泌及尿素合成功能;共同培养组与单纯肝细胞培养组在白蛋白分泌(13.75＞2.179,P＜0.05)及尿素合成功能(7.27＞2.179,P＜0.05)存在显著性差异,共同培养组明显高于单纯培养组.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,可以使肝细胞维持特异性功能,提高肝细胞活性.
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甘氨鹅脱氧胆酸钠致阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中bcl-2 mRNA的表达意义
目的:探讨bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的调控作用.方法:健康♂Wistar大鼠,进腹,游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予以结扎.进腹后不结扎切断胆总管作为阴性对照.结扎后3,7,14,21 d处死大鼠,每组8只.采用胶原酶原位肝灌注法获取体外培养正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠肝细胞.分别收取正常大鼠及胆总管结扎大鼠肝细胞1×109/L-1,用Trizol试剂盒一步法提取大鼠肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增;用PCR扩增bcl-2和对照β-actin基因片段;分离的正常大鼠及胆总管结扎14 d大鼠的肝细胞行原代培养,培养板内置小飞片,使用100μamd.L-1甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24h后,用FCM法分析肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测.结果:体外培养正常大鼠及结扎3 d大鼠肝细胞bel-2 mRNA的表达为阴性,仅见β-actin条带;胆总管结扎大鼠体外培养肝细胞在结扎后7 d即可见肝细胞内bel-2 mRNA的表达,其吸光度A值为O.13±0.15;结扎后14、2l d也可检测其表达,bcl-2 mRNA吸光度在结扎14 d达高峰,为O.56±0.21,且与结扎7、2l d相比,两者差异有显著性(P＜0.05);100tanol@L-1的G,CDC作用正常大鼠肝细胞后,凋亡明显增加,凋亡率为34.9±2.9%;胆总管结扎14d大鼠的肝细胞凋亡比率为15.6±2.1%,100μanol@L-1的GCDC作用胆总管结扎14 d大鼠肝细胞后,凋亡率无明显增加,为17.3±1.1%,两者差异无显著性(P＞0.05);GCDC作用的两组大鼠肝细胞凋亡率差异有显著性(P＜0.05).结论:阻塞性黄疸大鼠肝细胞有bcl-2基因的表达,正常大鼠肝细胞则无表达;在阻塞性黄疸过程中,大鼠肝细胞通过表达bcl-2来抑制胆盐致肝细胞的凋亡作用.
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肝细胞、胰岛细胞与储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响
目的:探讨肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响.方法:采用改良胶原酶消化法分离获得大鼠肝细胞和储脂细胞,同时利用梯度离心分离胰岛细胞.分两组实验,肝细胞培养组(对照组),肝细胞用RPMI1640、胰岛素10-7mol/L、100 mL/L FBS及地塞米松10-8 mol/L配成细胞悬液,2 mL放入9 cm2培养瓶中连续培养15 d(37℃50mL/LCO2).肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养组(实验组):将1×107/L的储脂细胞2 mL先加入培养瓶中,培养条件及培养液同肝细胞培养组,培养48 h后弃上清后将肝细胞2×108/L 2 mL和胰岛细胞(100个)分别加入并观察肝细胞存活情况;全自动生化分析仪测定培养上清液中总蛋白及尿素氮的含量;两组细胞均在培养10 d行细胞组织学及组织化学检测,包括肝细胞HE染色、肝细胞内糖原PAS染色及葡萄糖-6-磷酸酶染色检测.结果:培养第7 d对照组部分肝细胞脱落,核固缩,胞质破碎分解.而实验组肝细胞粘壁生长好,肝细胞、储脂细胞和胰岛细胞相间形成团状和索形.培养10 d对照组肝细胞核完全固缩,胞质破碎分解,糖原、葡萄糖-6-磷酸酶的表达消失;实验组肝细胞呈片状,胞质饱满,糖原、葡萄糖-6磷酸酶的表达良好.培养5 d后实验组白蛋白及尿素氮的合成明显高于对照组(P＜0.05).结论:肝细胞、胰岛细胞和储脂细胞共培养明显延长肝细胞存活期.
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丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞,用MTT法测定肝细胞的增生,荧光实时定量PT-PCR(Real Time RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测培养上清中的白蛋白.结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用,能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达,其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异,呈明显的浓度依赖关系.结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能,抑制肝细胞凋亡有关.
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清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用
目的:从细胞学水平研究自研中药清脂健肝方对酒精性肝损伤的防治作用.方法:原位灌流法分离大鼠肝细胞,建立酒精性肝损伤的体外培养模型,分别加入不同浓度中药原液,观察其对酒精性肝损伤的防治作用.结果:不同浓度的中药原液均可显著抑制肝细胞ALT、AST的漏出;减少肝细胞3H-甘油掺入率;降低肝细胞脂质过氧化产物丙二醛的升高,具有稳定肝细胞膜的作用,并呈现出量效关系.结论:从细胞学水平进一步证实,清脂健肝方能提高肝细胞的抗氧化力,可对酒精性肝病起防治作用.
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消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Hcoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h,再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng),加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64,6.01±0.68,5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,肝细胞caspase3mRNA的表达(5.51±0.72,4.87±0.45,3.08±0.82 ng)显著下调(P＜0.05,P＜0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1203.91±86.85 nkat,加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,其培养上清中AST活性降低为1092.39±57.01,1025.54±29.17,996.03±53.68 nkat,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,其培养上清中AST活性(998.70±30.67,885.51±44.82,753.48±35.17nkat)显著降低(P＜0.05,P＜0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用,均呈明显的血清浓度依赖关系.结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
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大鼠肝细胞缺氧预处理后基因表达谱的改变
离体培养的肝细胞经缺氧预处理后能耐受长时间缺氧,表明缺血预处理保护肝脏的现象也存在于体外[1].缺氧预处理保护肝细胞是一个受体介导的信号传导过程,但其确切机制至今仍不明了[1,2].为此,我们利用基因芯片技术研究缺氧预处理后肝细胞基因表达谱的变化,探索缺氧预处理预防肝细胞缺氧再灌注损伤的可能作用机制.
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异环磷酰胺对离体大鼠肝细胞毒作用机制研究
目的：探讨异环磷酰胺（Ifo）对混悬培养大鼠肝细胞的毒性效应及其可能机制。方法：以两步灌流法消化成年大鼠肝细胞，并进行混悬培养。Ifo以5，10，20 mmol/L染毒，观察染毒后3 h肝细胞的存活率、胞内酶泄漏情况以及肝细胞巯基状态、丙二醛（MDA）含量的变化，并对肝细胞表面形态和超微结构进行观察。结果：随着染毒浓度的增大，肝细胞存活率逐渐下降，胞内酶泄漏加重，培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性增高，同时肝细胞总巯基（TSH）、非蛋白巯基（NPSH）、蛋白巯基（PSH）也逐渐下降，其中PSH下降在TSH耗竭中起主要作用。肝细胞MDA含量未发现有显著增高。形态学检查发现Ifo使肝细胞表面出现“大疱”，胞内线粒体肿胀，空泡化，粗面内质网扩张，部分脱颗粒，内腔模糊，滑面内质网扩张，呈囊泡状改变。结论：Ifo对混悬培养大鼠肝细胞有损伤作用，巯基物质的降低在Ifo肝细胞毒性中起重要作用。
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环磷酰胺对离体大鼠肝细胞毒作用机理研究
目的探讨环磷酰胺(Cp)对混悬培养大鼠肝细胞的毒性效应及其可能机理.方法以两步灌流法消化成年大鼠肝细胞,并进行混悬培养.Cp以5、10、20mmol*L-1染毒,观察染毒后3h肝细胞的存活率、胞内酶泄漏情况以及肝细胞巯基状态、MDA含量的变化,并对肝细胞表面形态和超微结构进行观察.结果随着染毒浓度的增大,肝细胞存活率逐渐下降,胞内酶泄漏加重,培养液中LDH、ALT、AST活性增高,同时,肝细胞TSH、NPSH、PSH也逐渐下降,其中PSH下降在TSH耗竭中起主要作用.肝细胞MDA含量未发现有显著增高.形态学检查发现Cp使肝细胞表面出现"大疱”,胞内线粒体肿胀,空泡化,粗面内质网扩张,部分脱颗粒,内腔模糊,核固缩,核内染色质边集成块状.结论 Cp对混悬培养大鼠肝细胞有损伤作用,巯基物质的降低在Cp肝细胞毒性中起重要作用.
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2-乙基-3-羟基-6-苯硫基-4(1H)-吡啶酮对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的影响
目的研究2-乙基-3-羟基-6-苯硫基-4(1H)-吡啶酮(HPP)对四氯化碳(CCl4)损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用.方法原位灌流法分离大鼠肝细胞培养24 h后加入HPP,同时造成CCl4损伤,于损伤后24 h和48 h测培养液中丙二醛(MDA)含量、谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,48 h后用MTT法测肝细胞存活率.结果 HPP对GPT活力的升高有抑制作用,同时抑制MDA的产生及肝细胞损伤造成的GSH-Px活力的降低.结论 HPP能有效抑制CCl4造成的原代培养大鼠肝细胞损伤.
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细胞核成熟mRNA的转运
细胞核内成熟mRNA向胞浆的转运是制约细胞内蛋白质表达的重要环节,该过程由核被膜核苷酸三磷酸酶(NTPase)水解核内三磷酸核苷酸以提供转运所需的能量.目前细胞核mRNA转运的调控,尤其是疾病时mRNA转运的变化尚不清楚.我们观察到,在腹主动脉缩窄性大鼠心肌肥厚模型上,心肌细胞核被膜NTPase活性和mRNA转运均上调,提示mRNA转运水平的提高可能促进了心肌肥厚相关蛋白的表达.24月龄大鼠肝细胞核被膜NTPase活性和mRNA转运均下调,提示机体衰老时蛋白质合成降低与mRNA转运水平降低有关.盲肠穿孔引起的脓毒血症时,大鼠肝细胞核被膜NTPase活性与mRNA转运都呈早期升高、晚期下降的双向变化,这与脓毒血症早期血糖升高的高代谢型变化和晚期血糖降低的低代谢型变化相平行.
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脂肪酸对大鼠肝细胞与胰岛素结合的影响
2型糖尿病病人常伴有肥胖合并高胰岛素血症.由于腹腔静脉和门脉解剖结构特殊,在正常生理情况下,即存在生理性高浓度游离脂肪酸状态.
