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重组人乳铁蛋白致突变性研究
乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白,主要由乳腺上皮细胞表达和分泌.能参与铁代谢,促进铁吸收、抗微生物功能、抗病毒作用、免疫调节和抗感染、抗肿瘤、抗氧化作用,并作为细胞生长因子等被广泛地研究[14].尤其是在食品与营养,婴幼儿配方奶粉方面需求量非常大.但是,目前市场上的乳铁蛋白大多都是从牛乳中纯化得到的,生物活性远低于人乳铁蛋白.利用重组DNA和转基因技术,获得人乳铁蛋白在转基因牛奶中稳定、高效表达的重组人乳铁蛋白,并获得了国际上大的、遗传稳定的转基因奶牛繁育群体,为稳定供应乳铁蛋白,并且是活性更高、更适合人类吸收利用的人乳铁蛋白,提供了可靠的来源[5].
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重组人乳铁蛋白大鼠致畸试验
利用转基因与体细胞克隆技术培育高效表达重组人乳铁蛋白的转基因奶牛,转基因奶牛泌乳时重组人乳铁蛋白分泌至牛奶中.通过牛奶的收集、预处理、层析分离、病毒灭活与去除、超滤浓缩与缓冲液置换、无菌过滤、冷冻干燥等工艺步骤,获得纯度大于95％的重组人乳铁蛋白[1-3.现有的重组人乳铁蛋白毒理研究资料表明,重组人乳铁蛋白为无毒;同时也并不存在致敏性.但这些资料并没有在符合GLP的实验室开展,只能做为参考资料.本公司通过与符合GLP标准的实验室开展合作,研究重组人乳铁蛋白致畸效应,为其安全性评价提供一个有力的证据支持.
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源于转基因奶牛的重组人乳铁蛋白大鼠28d亚急性经口毒性试验
乳铁蛋白是一类具有多种功能的糖蛋白,广泛用于婴儿奶粉(调整铁的吸收,抗菌,增强免疫力,改善肠内菌群),营养保健食品(补铁,抗菌,增强免疫力,改善肠内菌群),化妆品(抗氧化),饲料添加剂(抗菌,增强免疫力),食品保鲜剂(抗菌),辅助药物(抗菌,增强免疫力)等方面[1-3].为了满足市场上对乳铁蛋白的需求,科学家们正致力于利用转基因技术,特别是转基因动物——乳腺生物反应器生产重组人乳铁蛋白的研究[4].研究表明,人乳铁蛋白各种主要功能优于牛乳铁蛋白,因此开发人乳铁蛋白等人源乳蛋白将更有市场前景和应用价值[5].为了探讨其食用安全性,本研究对重组人乳铁蛋白进行了大鼠28 d喂养试验.
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转基因水稻中重组人乳铁蛋白的分离纯化及其抑菌活性研究
目的 研究从转基因水稻中分离纯化重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF),并检测其是否具有抑菌活性.方法 通过饱和硫酸铵分级沉淀从转基因水稻中分离rhLF后,经CM Sepharose FF交换层析和Sephadex G25分子筛层析进一步纯化rhLF.采用微量肉汤稀释法检测不同浓度rhLF(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和5.00mg/ml)对鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌的抑制情况.结果 通过分离和纯化成功获得纯度较高的rhLF(纯度约90％),经考马斯亮蓝染色,Western blot和质谱仪鉴定分析确定为rhLF,分子量约为79 kD.抑菌实验显示,5.00和4.00mg/ml rhLF对鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌有持久的抑制效果,2.00和1.00mg/ml rhLF在实验后期也表现出明显的抑菌作用,0.50mg/ml及以下浓度则没有抑菌效果.5.00和4.00mg/ml rhLF在18h内对蜡样芽孢菌表现出一定的抑制效果；5.00mg/ml rhLF对单增李斯特菌在18h内有抑制作用.结论 从转基因水稻中可成功分离和纯化rhLF,纯化后蛋白仍具有明显的抑菌活性.
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重组人乳铁蛋白急性经口毒性试验和90天喂养试验
目的 评价转基因奶牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白食用安全性.方法 参照GB 15193.1-2014《食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序》进行小鼠急性经口毒性试验和大鼠90天亚慢性毒性试验.结果 急性经口毒性试验观察期内各小鼠均未见任何毒性效应,判断重组人乳铁蛋白的小鼠急性经口LD50＞ 20 000 mg/kg;90天喂养试验结果表明,给予动物人体推荐剂量300倍的重组人乳铁蛋白,未观察到有害作用,大鼠的无明显损害作用剂量水平(NOAEL)为10.00g/(kg·d).结论 重组人乳铁蛋白属无毒级,无亚慢性毒性,无潜在的食用安全风险.
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基于28天重复经口毒性的重组人乳铁蛋白动物试验研究
目的 评价重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)食用安全性和铁营养.方法 100只SPF级断乳SD大鼠按体重区组随机分为5组:普通饲料对照组,牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin,bLF) 100、200 g/kg组,重组人乳铁蛋白(rhLF)l00、200 g/kg组.对照组喂饲AIN-93啮齿类实验动物纯合饲料,bLF和rhLF组分别用受试物蛋白部分或全部替代配方中原有酪蛋白成分,其他成分保持不变,配制成动物喂饲饲料,大鼠自由进食饮水,观察28天.观察指标包括动物安全性指标(体重、摄食量、食物利用率、血液学、血生化、脏器系数)和铁营养指标(血清铁、总铁结合力、运铁蛋白饱和度、转铁蛋白受体).结果 200 g/kg bLF组和200g/kg rhLF组雌雄动物体重增长差异无统计学意义,但显著低于对照组(P＜0.05);100 g/kg和200 g/kg rhLF组大鼠血液学、血生化、大体解剖及组织病理学结果均未观察到有生物学意义的改变;bLF组和rhLF组血清铁水平和运铁蛋白饱和度差异无统计学意义,但较对照组均出现一定程度增高.结论 在本试验条件下,28天试验同剂量的rhLF对大鼠安全性指标和铁营养改善作用与bLF比较无生物学差异.
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重组人乳铁蛋白对缺铁性贫血大鼠铁营养状况的改善作用
目的 研究从转基因牛乳中分离纯化的重组人乳铁蛋白(rhLf)对缺铁性贫血(IDA)大鼠铁营养状况是否具有改善作用.方法 雌性断乳Wistar大鼠喂饲低铁饲料建立IDA模型,按造模结束时Hb和体重随机分为6组,即模型对照组(A组),0.375、0.75和2.25g/kg BW rhLf组(B、C、D组),0.011g/kg BW乳酸亚铁组(E组),0.375g/kg BW rhLf与0.011g/kg BW乳酸亚铁联合补充组(F组),每组12只,每天一次性灌胃给予受试物,连续8周.检测指标包括动物一般情况、体重变化、Hb和RBC、游离原卟啉(FEP)、血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、运铁蛋白饱和度(TS)、血清铁蛋白(SF)、血清Cu和血清Zn.结果 与A组相比,E、F组大鼠一般情况明显改善,体重、RBC、Hb、SI、TS和SF显著增加,FEP、TIBC和血清Zn降低,机体铁营养状态基本恢复正常；D组上述指标较A组同样有显著性差异,但改善程度低于E、F组,动物仍处于缺铁状态；C组RBC较A组显著增加,FEP和血清Zn显著降低,其他指标无差异；B组仅血清Zn显著低于A组,其他指标无差异.E、F两组比较时,F组SI、TS和SF均显著高于E组,TIBC低于E组.结论 单纯补充rhLf对IDA大鼠铁营养状况具有一定程度的改善作用,但较乳酸亚铁弱；乳酸亚铁与rhLf联合应用时改善机体铁营养状况的作用强于单纯补充乳酸亚铁或rhLf,同时可减轻亚铁离子导致的不良反应.
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重组人乳铁蛋白抗氧化活性研究
目的 考察重组人乳铁蛋白自身及其在奶粉中的抗氧化活性.方法 通过二苯代苦味肼基(DPPH)自由基抑制率、羟基自由基抑制率、超氧阴离子自由基抑制率、还原能力和抑制大鼠肝脏体外脂质过氧化等试验评价重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的体外抗氧化性能.结果 重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的浓度与DPPH自由基抑制率、抑制羟基自由基能力、抑制超氧阴离子自由基能力和还原能力之间呈明显剂量-效应关系,且差异有统计学意义(P＜0.05);样本和浓度之间没有交互作用,重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在不同浓度下所得值的趋势相同.重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在对大鼠肝组织匀浆抗氧化性影响差异有统计学意义(P＜0.05),不同浓度乳铁蛋白之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白具有一定的抗氧化活性,可以添加到保健品或者化妆品中作为天然抗氧化剂.
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重组人乳铁蛋白对子代大鼠免疫功能影响的一代繁殖毒性扩展试验
目的 研究转基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白(rhLF)对子代大鼠免疫功能的影响.方法 参照一代繁殖毒性扩展试验指南设计试验,将Wister大鼠分为对照组(酪蛋白)、重组人乳铁蛋白组,每组30只雌鼠、15只雄鼠;按照蛋白占比为20％的比重掺入饲料进行全食物喂养.雌/雄大鼠喂养相应饲料两周后进行交配,各组雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期继续给予相应饲料,子代大鼠从断乳到处死继续给予相应饲料.子代大鼠分别在PND0(出生后0天)、PND21(出生后21天)和PND56(出生后56天)进行免疫功能评价.结果 重组人乳铁蛋白组与对照组比较,重组人乳铁蛋白组子代大鼠血常规、血生化和淋巴细胞分型结果未见明显改变;溶血空斑试验(PFC)、淋巴细胞增殖试验及自然杀伤细胞(NK细胞)活性试验指标结果均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在本研究的试验条件下,重组人乳铁蛋白对子代大鼠免疫功能未见不良影响.
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含重组人乳铁蛋白乳粉蛋白质营养学评价
目的 评价牛乳腺生物反应器表达的重组人乳蛋白乳粉蛋白质的营养价值.方法 选用100只清洁级刚断乳(出生后20～23 d)SD大鼠(雌、雄各半),按性别、体质量随机分为5组:重组人乳蛋白乳粉组、普通乳粉组、酪蛋白乳粉组、牛乳铁蛋白乳粉组、重组人乳铁蛋白乳粉组,分别喂饲相应饲料28 d,观察大鼠的进食量、体质量,测定血常规、血生化情况,试验末期处死动物,称量脏器重量并对脏器进行病理学检查,计算蛋白功效比和校正蛋白功效比,对氨基酸评分.结果 重组人乳铁蛋白乳粉雄性动物组总体蛋白功效比值差异有统计学意义(P＜0.05),但重组人乳铁蛋白乳粉组雄性和其他对照组差异无统计学意义(P＞0.05).雌性动物重组人乳铁蛋白乳粉组和其他对照组蛋白功效比值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组人乳铁蛋白乳粉的蛋白功效和其他组相比并无较大区别,氨基酸评分结果显示苯丙氨酸和酪氨酸为第一限制氨基酸,与普通乳粉一样.
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重组人乳铁蛋白在体外模拟胃肠环境中稳定性研究
目的 研究重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rHLF)分别在体外模拟胃液和模拟肠液中的消化稳定性.方法 采用模拟胃液和模拟肠液在体外建立模拟胃肠环境消化体系,测定重组人乳铁蛋白在胃肠环境中的稳定性.重组人乳铁蛋白在模拟胃、肠液中的浓度分别为5.0和2.0 mg/ml.在重组人乳铁蛋白与模拟胃/肠液反应后的0、15、30 s和1、2、5、10、20、30、60 min取样,根据SDS-PAGE凝胶电泳结果,判断重组人乳铁蛋白在模拟胃、肠液环境中的稳定性.结果 重组人乳铁蛋白在体外模拟胃液中2 min内降解,在模拟肠液中60 min内不能完全降解.结论 重组人乳铁蛋白在体外模拟人体胃肠环境中易被降解消化.
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乳铁蛋白治疗严重脓毒症：口服重组人乳铁蛋白治疗严重脓毒症的Ⅱ/Ⅲ期临床试验结果
?乳铁蛋白Talactoferrin是一种重组人糖蛋白，已有许多研究证明其对免疫系统影响广泛。有相关学者进行了一项多中心随机安慰剂对照的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，评价在标准基础上加用Talactoferrin或应用安慰剂对严重脓毒症患者的疗效。该研究纳入来自10个国家、77个医疗中心中年龄＞18岁并接受抗菌药物治疗的严重脓毒症患者。干预措施为口服或经胃肠道给予重组人乳铁蛋白Talactoferrin?1.5?g、?每日3次，或应用安慰剂，疗程为28?d或转出重症加强治疗病房（ICU）。该研究在纳入305例患者时（153例接受Talactoferrin治疗，152例接受安慰剂），因为治疗无效和存在安全问题而提前终止。两组患者的年龄、性别、?感染部位、?严重程度评分等基线资料差异无统计学意义。与安慰剂组比较，Talactoferrin组患者28?d病死率较高（24.8%比17.8%），但未体现出统计学差异（P＝0.117）；其中209例休克患者两组28?d病死率差异显著〔Talactoferrin组31.4%（33/105）比安慰剂组20.2%（21/104），P＝0.064〕，而无休克患者差异无统计学意义〔Talactoferrin组10.4%（5/48）比安慰剂组12.5%（6/48），P＝0.806〕。与安慰剂组比较，Talactoferrin组住院病死率和3个月病死率明显升高〔住院病死率为28.1%（43/153）比17.8%（27/152），P＝0.037；3个月病死率为30.1%（46/153）比20.4%（31/152），P＝0.036〕。治疗相关的不良事件和严重不良事件的发生率在两组间是相似的。研究者得出结论：口服重组人乳铁蛋白Talactoferrin并不能降低严重脓毒症患者的28?d病死率，甚至可能是有害的。
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重组人乳铁蛋白对小鼠沙门菌感染抑制效果
目的 研究转基因水稻来源的重组人乳铁蛋白(rhLF)在小鼠体内抑制沙门菌感染的效果.方法 选择Balb/c小鼠建立沙门菌感染模型;将Balb/c小鼠按体重随机分为2组,即沙门菌对照组和rhLF干预组,每组12只;染菌前2h,rhLF干预组小鼠经口灌胃20 mg/mL rhLF 0.3mL,对照组小鼠经口灌胃0.3mL PBS;之后每天灌胃相同量的rhLF(6 mg/d)或PBS;每天观察小鼠一般情况;7d后,心脏穿刺取小鼠血液观察菌血症,取肝脏和脾脏组织进行细菌计数分析,取肝脏、脾脏、肾脏和小肠进行病理观察.结果 各组小鼠体重变化、生存情况在组间无明显差异(P＞0.05);2组小鼠的肝脏重和肝体比值、脾脏重和脾体比值相似(P ＞0.05);rhLF干预组小鼠的血液、肝脏和脾脏的染菌率和染菌量与对照组相比,呈现降低趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);病理分析显示rhLF干预组小鼠的炎症程度有减轻,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 6 mg/d的rhLF不能明显减轻小鼠沙门菌感染的炎症程度.
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家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎药物研究
目的：研究家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎的药物治疗效果。方法：选取我院2013年10月－2014年11月间诊治的溃疡性结肠炎患者110例，将其随机分为观察组和对照组各55例，对观察组患者采用家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服方式治疗，对对照组患者采用柳氮磺胺吡啶治疗，对比观察两组患者的临床治疗效果及不良反应。结果：观察组患者的总有效率为94.55％，对照组患者的总有效率为80.00％，观察组明显高于对照组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；在不良反应发生率方面，观察组患者为9.09％，对照组患者为21.82％，观察组明显低于对照组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。结论：采用家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎不仅可以显著提高临床治疗效果，而且还能降低不良反应的发生率，值得临床推广使用。
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转基因牛乳中重组人乳铁蛋白中试纯化工艺的建立及其活性分析
目的 建立转基因牛乳中重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)的中试纯化工艺,并分析纯化的rhLF的活性.方法 以含rhLF的转基因牛乳为原料,通过陶瓷膜分离技术除菌,一步阳离子交换层析,非离子型去污剂与金属络合剂去除内毒素,以及超滤浓缩脱盐,冷冻干燥制备重组蛋白纯品等步骤纯化rhLF,采用SDS-PAGE、凝胶过滤色谱(SEC-HPLC)法和反相色谱(RP-HPLC)法分析rhLF的纯度;ELISA法检测rhLF的含量;鲎试剂法检测rhLF的内毒素含量;圆二色谱技术分析rhLF的二级结构;并检测rhLF的铁结合能力和抑菌活性.结果 纯化的rhLF的平均纯度可达96％,内毒素含量小于0.5EU/mg,整个工艺回收率达75％,且具有与天然人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)相近的二级结构及正常的铁结合能力和抑菌活性.结论 建立的牛乳中rhLF的中试纯化工艺简便高效,适用于rhLF的规模化生产.
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重组人乳铁蛋白对食管癌细胞体外增殖的影响
目的:研究重组人乳铁蛋白(rhLF)对体外培养的食管癌细胞的生长特性的影响.方法:MTT法评定rhLF对人食管癌细胞Eca-109、人肝脏细胞L0-2、CHO中国昌鼠细胞系的生长抑制作用.结果:重组人乳铁蛋白对人食管癌细胞系Eca-109的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖性,对正常细胞无抑制作用.结论:重组人乳铁蛋白作为新的抗肿瘤化学治疗荆,可以抑制食管癌细胞Eca-109的增殖.
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重组人乳铁蛋白对口腔癌KB细胞增殖及凋亡影响的研究
目的 研究重组人乳铁蛋白(recombinate human lactoferrin,rhLF)对人口腔KB细胞增殖及凋亡的影响,为口腔癌患者提供新的有效治疗途径提供参考.方法 采用CCK-8法检测不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)的rhLF分别处理KB细胞24、48、72 h后对细胞增殖的影响;Immunofluorescence及Western blotting方法检测rhLF处理前后DNA损伤相关蛋白γ-H2 AX的表达.并分别用0、50、200μg/mL的rhLF处理KB细胞,14 d后观察其对集落克隆形成的影响;0、200μg/mL rhLF处理KB细胞48 h后,收集细胞并使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测rhLF处理前后线粒体膜电位的变化.Annexin V-PI染色检测rhLF对口腔癌KB细胞凋亡的影响;Western blotting检测0、50、200μg/mL的rhLF处理口腔癌KB细胞48 h后Parp、Caspase-3的表达情况.结果 rhLF处理KB细胞的增殖有显著的抑制作用.Immunofluorescence结果显示rhLF处理后γ-H2 AX的表达明显增加,Western blotting结果也显示rhLF处理后γ-H2 AX的表达成浓度依赖性增加.rhLF抑制KB细胞集落克隆的形成;JC-1荧光检测结果表明红绿荧光的相对比例降低,这种红绿荧光的相对比例降低提示膜电位下降;0、50、200μg/mL的rhLF处理口腔癌KB细胞48 h的凋亡率为2.02％、7.60％、48.07％;同时rhLF刺激口腔癌KB细胞能诱导Parp、Caspase-3的激活.结论 rhLF能显著抑制KB细胞的增殖并且诱导其细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡途径的激活应激有关.
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转基因牛乳中重组人乳铁蛋白的仿生亲和纯化
目的 从转基因牛乳中亲和纯化重组人乳铁蛋白.方法 从仿生亲和介质库中筛选亲争配体,进行重组人乳铁蛋白的纯化研究.结果 筛选出可以特异性结合重组人乳铁蛋白的固定化β-丙氨酸亲和配体,从转基因牛乳中一步纯化的重组人乳铁蛋白纯度为95.2%,蛋白回收率可达81.9%.经放大实验表明该亲和纯化工艺适合工业上大规模纯化乳铁蛋白.结论 固定化β-丙氨酸可从转基因牛乳中纯化出高纯度重组人乳铁蛋白,工艺适合工业化生产.
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重组人乳铁蛋白作为化妆品新原料的安全性评价
目的 评价重组人乳铁蛋白作为化妆品新原料对哺乳动物局部皮肤、眼睛的刺激作用或腐蚀作用,以及皮肤光毒性的作用.方法 通过家兔多次皮肤刺激性试验和急性眼刺激性试验考察重组人乳铁蛋白的多次皮肤刺激和眼刺激损伤状况,通过豚鼠皮肤光毒性试验考察重组人乳铁蛋白接受光照射后安全性.结果 重组人乳铁蛋白对家兔局部皮肤和眼睛均无刺激性.豚鼠皮肤局部涂抹重组人乳铁蛋白后进行UVA照射,未引起皮肤光毒性反应.结论 重组人乳铁蛋白安全,对皮肤和眼睛均无刺激性且无光毒性.
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重组人乳铁蛋白对口腔癌细胞周期及周期因子表达影响的实验研究
目的:探讨重组人乳铁蛋白(Recombinate human lactoferrin,rhLF)对口腔癌Tca8113细胞周期及周期调控因子cyclinD1、p19 和 p27 基因表达的影响.方法:分别采用流式细胞仪和RT-PCR方法分析细胞周期及周期调控因子cyclinD1,p19和p27的mRNA水平.结果:50 μg/mL、100 μg/mL rhLF作用Tca8113细胞后,细胞增殖减慢,G0/G1期细胞明显增多,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);Tca8113 细胞的cyclin D1mRNA表达下降显著,50 μg/mL和25 μg/mL rhLF 实验组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);p19和p27mRNA表达水平的变化不明显.结论:rhLF通过下调口腔癌细胞周期蛋白cyclinD1的表达来调控周期阻滞,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础.
