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采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位
目的 从随机肽库中筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,以建立无需黄曲霉毒素B1偶联抗原的免疫学检测方法.方法 利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,ELISA鉴定阳性克隆,通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析.结果 通过4轮结合/扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的职性克隆子,经DNA测序得到HXXDPXH共有序列,其中X为任意氨基酸.以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法,线性范围为500～2000 pg/ml,检测下限为50pg/ml.结论 利用噬菌体展示技术筛选到了黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,并以其代替黄曲霉毒素B1偶联抗原建立了免疫学检测方法.
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噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究
目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法.方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列.结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸.以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pg/ml,检测下限为150pg/ml.结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法.
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应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体
目的 利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法.方法 以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆.结果 通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆.其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1-20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml.结论 从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测.
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噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用研究
噬菌体展示技术是一项筛选技术,能将外源多肽或蛋白质与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,并展示在噬菌体颗粒的表面.因此,可通过该技术获得真菌毒素的模拟表位和抗真菌毒素的重组抗体,这为利用免疫学原理建立无毒检测体系检测真菌毒素带来了新的模式.本文综述了近几年噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用研究.
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丙型肝炎病毒高变区1模拟表位的交叉反应性分析
研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)高变区1(Hypervariable region 1,HVR1)抗原表位的交叉反应性,获取高反应性的抗原表位.设计并合成5种HVR1模拟表位基因,构建编码HVR1模拟表位的表达载体,表达并纯化表位蛋白.ELISA法检测表位蛋白与35份HCV抗体阳性血清的交叉反应性.包装HCV假病毒(HCV pseudotype particles,HCVpp),评价表位蛋白免疫BALB/c鼠血清在假病毒感染Huh7.5细胞中的作用.结果表明,表达纯化的5种表位蛋白(P1、P2、P5、P6、P8)均可与HCV抗体阳性血清反应,阳性反应率分别为54.3%(P1)、62.9%(P2)、80%(P5)、68.6%(P6)、54.3%(P8).表位蛋白P6、P8免疫BALB/c鼠血清对HCV假病毒感染Huh7.5细胞具明显的抑制作用.结果提示,选取的HVR1模拟表位在HCV感染免疫与疫苗研制中可能具有潜在的价值.
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从噬菌体12肽库筛选旋毛虫抗原模拟表位
为研究和开发新的旋毛虫病诊断抗原和疫苗,以纯化旋毛虫病患者血清免疫球蛋白(Ts-Ig)对噬菌体12肽库进行5轮筛选获得旋毛虫抗原模拟表位,随机挑选24个克隆,通过ELISA选取吸光度(A)较高的6个克隆(T1～T6)并检测其灵敏性和特异性.结果显示:T1～T6灵敏性与旋毛虫幼虫抗原(TsA)相同(阳性反应率:100%,P＞0.05),特异性与TsA无明显差异(阳性反应率:0～40%,P＞0.05),其中T3,T6与肺吸虫病患者血清无交叉反应,特异性高于TsA(P＜0.05),T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应,特异性亦高于TsA(P＜0.05),证实利用噬菌体12肽库可以成功地筛选到旋毛虫抗原模拟表位,为旋毛虫病诊断抗原和疫苗的研究和开发提供了新的研究途径.
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应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位
目的从噬菌体12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位. 方法将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白 ( Ig ) 作为靶分子筛选噬菌体随机12肽库.经过5轮淘筛,随机挑取24个蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值. 结果 24个克隆中有12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别,其中有2个克隆(P5、P6)具有较好的特异性和敏感性,可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位. 结论应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位,为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据.
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模拟表位型EB病毒感染诊断抗原的制备
目的 利用大肠埃希菌表达系统获取模拟表位型诊断抗原用于EB病毒(epstein-Barr virus,EBV)感染的早期诊断,并初步评价其抗原性.方法 将EB病毒模拟表位GP125、F1、A2、A3 C2多肽序列用特定连接臂串联,密码子优化后全基因合成;将目的片段插入带有Trx标签的表达质粒中,在大肠埃希菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blot技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立EBV-IgM抗体检测捕获法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 所获取EBV模拟表位诊断抗原浓度为2.8 mg/ml,纯度为99.01％;Western blot实验发现,以anti-Trx单克隆抗体或EBV-IgM阳性血清作为第一抗体,在NC膜约26×103处都可以发现特异条带(与预期一致);对50份EBV急性感染阳性血清和50份阴性血清进行检测得出,阳性血清样本OD值1.352 (95％ CI:1.233 ～1.489)与阴性血清样本OD值0.135(95％ CI:0.113 ～0.159)分布区组明显(P＜0.05),其中灵敏度为98.0％,特异性为96.0％,一致性检验kappa值为0.940,一致性优异.结论 原核表达与亲和及离子交换层析纯化可以获取抗原性良好的EBV感染诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于EBV-IgM捕获法ELISA血清学检测中.
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应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位
目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.
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HCV HVR1相关基因诱导小鼠免疫反应的比较
目的 对小鼠进行两种基因免疫方法的比较:分别以真核质粒pcDN3.1(+)为载体和以伤寒减毒活菌苗为载体,携带丙肝病毒高变区1(HVRI)相关模拟表位的DNA序列,诱导细胞免疫应答,以寻找较好的疫苗免疫途径.方法 根据HCV HVR1模拟表位的肽序列合成DNA序列,并将其连接到pcDN3.1(+)(pcDN3.1-SP)真核质粒上,然后用重组质粒转化伤寒减毒活菌苗Ty21a(Ty21a-SP).Ty21a-SP和peDN3.1-SP分别经口服和肌注免疫小鼠后,杀鼠、分离脾细胞,脾细胞经混合肽刺激后,用流式细胞仪检测CD8+IFN-γ+细胞;用非放射性MTS法检测细胞增殖反应;以非放射性LDH法检测CTL反应.结果 对小鼠用pcDN3.1-SP和Tyr21a-SP免疫后,取脾淋巴细胞经混合肽刺激后,明显增殖,CD8+IFN-γ+淋巴细胞比例增高,并诱导较强的CTL反应,但pcDN3.1-SP免疫后的上述反应较Ty21a-SP免疫弱.结论 使用伤寒减毒活菌苗作为载体进行基因免疫有利于产生细胞免疫反应.
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应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白抗原模拟表位
为筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)特异性噬菌体12肽模拟表位,应用噬菌体表面展示技术,以抗-HCV核心蛋白抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工化学合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取50个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定,并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV核心抗原的模拟表位.经免疫学鉴定后,从随机筛选的50个克隆中确定10个阳性克隆,进行DNA序列测定,确定氨基酸序列XRQXXPXXXHXX为HCV核心的模拟表位.本实验为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
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丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属,基因组为单股正链RNA,其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒截然不同.由于诱导中和抗体的抗原表位恰好位于其包膜抗原E2蛋白的高变区1(HVR1),因而容易逃避机体的免疫监视,形成慢性感染,同时造成发展广谱预防性疫苗的困难.噬菌体表面展示技术和模拟表位的理论和技术,是构建新型蛋白或基因疫苗,克服这一困难的可能途径.HCV基因复制和翻译有关的调节基因序列与肝细胞来源的蛋白质之间相互作用的研究,将有助于阐明HCV调节机制和相对嗜肝特性的分子生物学基础;HCV特异性受体的研究,将有助于阐明HCV感染并进入肝细胞的各个细节;酵母双杂交技术对于HCV结构和非结构蛋白结合的肝细胞蛋白的筛选,以抑制性消减杂交(SSH)技术对HCV蛋白调节的肝细胞靶基因的筛选,将有助于阐明HCV与肝细胞大分子之间相互作用的分子机制.所有这些,将为终揭密HCV感染引起慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌、肝脏脂肪变、B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等的分子生物学机制,并为反义技术、人源化单链可变区抗体为目的基因的细胞内免疫基因治疗和治疗性基因疫苗等抗HCV治疗新型方法的研究奠定了坚实的基础.
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志贺毒素B亚单位及其模拟表位的制备和免疫保护效应
目的:对重组表达的StxB和预测的模拟表位肽进行免疫保护效应评价.方法:用分子生物学方法构建基因工程菌,IPTG诱导表达重组StxB,经复性后进行离子交换层析纯化.同时采用生物信息学手段对StxB的表位相关参数进行分析,预测StxB可能的抗原表位.以纯化的StxB和合成的模拟表位肤免疫小鼠后攻毒,评价StxB及其模拟表住肽的免疫保护效应.结果:表达并制备了90%以上纯度重组StxB;发现p14和p17多肽易形成转角和无规卷曲的柔性区段,可及性、极性和亲水性较强,是可能的抗原表位.免疫保护试验显示,经重组StxB和合成多肽免疫的小鼠发病延迟.症状减轻,存活率显著提高.结论:重组StxB和预测的模拟表住肽具有良好的免疫保护效果.为亚单位疫苗及其作用机制的研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子影响的研究
目的 观察丙型肝炎病毒(HCV)高变区1(HVR1)模拟表位7肽(7P)对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7)细胞释放细胞因子的影响.方法 体外培养小鼠RAW264.7细胞,用LPS刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6,用不同浓度(5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL)的7P进行干预,应用单溶液细胞增殖(MTS)法检测7P对细胞活力的影响,应用酶联免疫吸附实验(ELISA) 法检测细胞培养上清中促炎细胞因子的含量.结果 7P可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL- 6,并呈一定的量效关系,其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关.结论 7P呈浓度依赖性地抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6.
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利用Sm抗原模拟表位肽构建狼疮样鼠模型
目的 利用Sm抗原模拟表位肽免疫BALB/C小鼠,构建狼疮样鼠模型.方法 用鼠Sm单克隆抗体对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,将筛选的噬菌体阳性克隆行双抗体夹心ELISA检测、DNA序列测定并推导其氨基酸序列,初步确定Sm抗原模拟表位;进而用混合噬菌体阳性克隆皮下免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测小鼠血清IgG型抗Sm抗体、抗双链DNA(dsDNA)抗体和抗核抗体(ANA)水平;直接免疫荧光检测小鼠肾脏IgG型免疫复合物的沉积以及HE染色观察小鼠肾脏组织病理损伤情况.结果 免疫筛选获得的5个ELISA强阳性的噬菌体克隆的氨基酸序列IR、SQ、PP出现频率增加;实验组小鼠血清中第28天出现Sm抗体、dsDNA抗体、ANA抗体,且滴度不断升高;第33天出现蛋白尿;肾脏可以检测到IgG型免疫复合物沉积及明显的肾脏病理改变.对照组小鼠无明显自身抗体产生和肾脏病变.结论 利用Sm抗原噬菌体模拟表位肽可成功构建狼疮样小鼠模型.
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模拟表位淘选及应用
目的 从噬菌体随机七肽库中淘选脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的模似表位,并以之替代人工抗原建立ELISA检测方法.方法 利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体12D1,从噬菌体随机七肽库中淘选到脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模似表位,七肽模拟表位氨基酸序列为CMRPWLQ.以含有DON七肽模拟表位的噬菌体替代DON人工抗原建立DON间接竞争ELISA检测方法,检测范围为20～400 ng/ml,并应用于小麦、玉米样品中DON含量的检测.结果 检测结果与德国r-Biopharm公司DON检测试剂盒差异无统计学意义.结论 DON噬菌体模拟表位替代DON人工抗原建立的ELISA检测方法可应用于小麦和玉米样品中DON的检测.
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黄曲霉毒素B1抗原模拟表位高效表达
目的 构建黄曲霉毒素B1(AFB1)模拟表位pⅧ噬菌体展示载体,为建立无毒害免疫学检测方法提供依据.方法 构建呈现AFB1抗原模拟表位的噬菌体载体,并引入肠激酶酶切位点,诱导表达,肠激酶处理重组噬菌体颗粒,酶联免疫吸附法鉴定反应原性.结果 重组质粒酶切谱、PCR扩增结果及测序结果均与设计一致,在pC89载体中插入了GACGACGACGACAAGCATCCTAGTGATCCGCGTCATGGG序列,肠激酶处理后的重组噬菌体颗粒可与AFB1抗体特异性结合,吸光度(A)值可达2.112.结论 成功构建了包含肠激酶酶切位点的AFB1抗原模拟表位pⅧ噬菌体表达载体,重组噬菌体颗粒经初步表达有一定反应原性.
关键词： 黄曲霉毒素B1(AFB1) 模拟表位 pC89 肠激酶 -
噬菌体肽库中筛选NMDA受体模拟抗原
[目的] 研究发现脑缺血患者体内存在N甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体自身抗体,了解其滴度与疾病程度的相关性.[方法] 用NMDAR1单克隆抗体淘筛噬菌体展示随机12肽库,获得NMDAR1模拟表位抗原.[结果] 细胞竞争ELISA结果显示,该模拟抗原可以竞争细胞表面天然抗原与抗体的结合,具有抗原模拟性.[结论] 噬菌体肽库中筛选NMDAR1受体模拟抗原可以用于临床病人血清检测.本研究为下一步临床检验准备了必要条件.
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用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位
目的:筛选法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体所针对的模拟抗原表位.方法:以纯化的3株IBDV单克隆抗体为靶分子用噬菌体12肽库筛选相应抗原模拟表位；应用间接和竞争ELISA鉴定所筛选的阳性样品；后对与抗体高亲和结合的噬菌体进行测序分析.结果:经过四轮淘洗,随机挑取30个克隆经间接ELISA鉴定,发现其中22个克隆结合活性较高.进一步应用竞争ELISA,获得14个噬菌体克隆,其抑制率高达50％以上.对这些噬菌体进行DNA测序,并分析比对了IBDV相应序列,确定了3个抗原模拟表位.结论:通过噬菌体随机肽库成功筛选出3个IBDV模拟表位,为进一步研究IBDV抗原性质奠定了基础.
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结核分枝杆菌抗原模拟表位肽的筛选及免疫活性鉴定
目的:从噬菌体随机12肽库中筛选结核分枝杆菌模拟抗原表位,并初步研究其免疫活性.方法:以鹿结核阳性血清纯化多克隆抗体IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增过程进行3轮筛选,随机挑取20个单克隆进行特异性鉴定,将筛选后得到的阳性克隆扩增后免疫BALB/c小鼠作为实验组;以TBS为阴性对照组,BCG为阳性对照组,采用间接ELISA方法检测抗体效价,MTT法检测淋巴细胞增殖能力.每组小鼠免疫3周后再鼻腔接种BCG,3周后无菌取左全肺研磨计算肺脏荷菌量,取右全肺制备病理切片观察肺脏病理变化.结果:经三轮筛选后阳性克隆得到富集,ELISA鉴定20个单克隆中有15个阳性克隆,阳性率为75%.免疫后实验组小鼠抗体水平高于BCG组(P<0.01).小鼠脾淋巴细胞增殖实验,经ConA、LPS、PPD刺激后实验组SI值均高于BCG组,但差异无显著性(P>0.05),与TBS组比较差异有显著性(P<0.01).实验组、BCG组均观察到少量的淋巴细胞浸润,而TBS组肺泡结构消失,组织发生实变.肺脏荷菌量实验显示实验组肺脏荷菌量[(4.080±0.035)log CFU·mg-1)]低于TBS组[(4.360±0.110)log CFU·mg-1](P<0.01),但高于BCG组荷菌量[(3.980±0.023)log CFU·mg-1](P>0.05).结论:成功筛选得到含有结核分枝杆菌抗原模拟表位的阳性克隆,这些阳性克隆能有效诱导小鼠产生比BCG更高的抗体效价和保护效应,对其进行进一步序列测定和功能分析将有助于结核病疫苗的开发.
