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白藜芦醇对UVB损伤HaCaT细胞保护作用的双向电泳图谱差异分析
目的 利用双向电泳技术(2-DE)从蛋白质组学角度分析白藜芦醇对中波紫外线(UVB)照射的人角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用,以探讨白藜芦醇防御UVB损伤的作用靶点及有关机制.方法 MTT法检测不同浓度的白藜芦醇对经或不经UVB照射的HaCaT细胞增殖的影响.2-DE实验分对照组、UVB组、白藜芦醇组、UVB+白藜芦醇干预组(共同干预组),提取各组蛋白进行2-DE实验,结合质谱(M ALDI-TOF-MS)分析与数据库检索对差异蛋白质点进行鉴定.结果 筛选10个存在明显差异的蛋白点,质谱鉴定出8种蛋白质,除4种功能未知蛋白外,其余4种蛋白分别为转录起始因子IIE-β( TFIIE-β)、组蛋白H1.2、锌指蛋白、MAGOH蛋白.UVB组细胞内组蛋白H1.2水平较其它各组明显增高(P＜0.05)；UVB组、UVB+白藜芦醇干预组的TFIE-β及锌指蛋白表达水平均降低,UVB组下降为明显(P＜0.05)；UVB组的MAGOH蛋白较各组明显减少(P＜0.05).结论 应用2-DE联合质谱技术发现了白藜芦醇对UVB诱导的HaCaT细胞损伤防护作用相关的差异蛋白点.
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葡萄籽原花青素及UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响
目的 观察葡萄籽原花青素(GSPE)和长波紫外线(UVA)对人角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖的影响,以探讨GSPE有无光保护作用.方法 MTT法分别测定不同浓度GSPE以及不同剂量UVA对HaCaT细胞增殖活性的影响.结果 GSPE浓度为5～200 μg/mL时,对HaCaT细胞增殖影响不明显,浓度为500 μg/mL及以上时抑制细胞生长,且有统计学意义;UVA剂量超过10J/cm2有抑制作用且随剂量增高抑制作用越明显,且有统计学意义,25J/cm2时其抑制率达37.65％;浓度为50、100 μg/mL的GSPE对25 J/cm2 UVA照射后的HaCaT细胞的增殖有明显促进作用.结论 25 J/cm2的UVA对HaCaT细胞的增殖有明显抑制作用,而合适浓度的GSPE对HaCaT细胞增殖活性有光保护作用.
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丹参素对中波紫外线照射后人角质形成细胞的保护作用
目的 研究丹参素对中波紫外线(UVB)照射后人角质成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用及其可能机制.方法 将人角质形成细胞HaCaT细胞分为5组:空白组、UVB组和低、中、高3个浓度实验组.空白组细胞不做任何处理,UVB组用30 mJ·cm-2 UVB处理,实验组用低、中、高3个浓度(1,10,100nmol·L-1)丹参素预处理24后,再用30 mJ·cm-2 UVB处理.用比色法测定干预后HaCaT细胞活力和LDH释放量;用氧化敏感荧光探针检测细胞中活力氧簇(ROS)水平;用免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白表达水平.结果 空白组、UVB组和低、中、高3个浓度实验组的细胞活力分别为(100.00±0.00)％,(71.30±3.78)％,(84.83±4.95)％,(90.62±11.07)％和(91.90±14.74)％;这5组的LDH释放量分别为0.72±0.04,1.10±0.05,0.88 ±0.06,0.90±0.03和0.87±0.08;这5组的ROS水平分别为54.43±0.22,86.67±3.35,76.75±2.06,76.36±2.34和73.30±2.16,UVB组与空白组相比,细胞活力明显下降,而LDH释放量与ROS水平均明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01);低、中、高3个浓度实验组与UVB组比较,细胞活力明显升高,而LDH释放量与ROS水平均明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05,或P＜0.01).这5组的蛋白表达水平(Bcl2与Bax蛋白表达量比值)分别为0.52±0.06,0.24±0.02,0.35±0.04,0.27±0.01和0.22±0.02,UVB组与空白组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01);低、中2个浓度实验组与UVB组相比,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).结论 丹参素可以抑制UVB诱导的细胞凋亡.
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凋亡相关斑点样蛋白和胱天蛋白酶1在皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中的表达及意义
凋亡相关斑点样蛋白（ASC）是多种炎症小体，如NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等所共有的接头蛋白，通过诱导胱天蛋白酶（caspase）-1自活化引起下游炎症因子的产生［1］。ASC在健康人角质形成细胞高表达。而在肿瘤组织中，ASC和caspase-1具有双重作用，即通过诱导炎症微环境而促进肿瘤和通过诱导细胞程序性死亡、维持细胞自稳态而抑制肿瘤，且这种双重作用依赖于不同的细胞类型［1，2］。我们观察了ASC和caspase-1在皮肤鳞状细胞癌（SCC）和基底细胞癌（BCC）中的表达，探讨其可能的作用和意义。
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长波紫外线对人角质形成细胞分泌MMP-1mRNAMMP-3mRNA及MMP-9mRNA的影响
目的 研究长波紫外线(Ultraviolet A,UVA)对人角质形成细胞(HaCaT cells)分泌基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)MMP-1 mRNA、MMP-3 mRNA及MMP-9 mRNA的影响.方法 复苏培养HaCat细胞,绘制细胞生长曲线,确定HaCaT细胞的指数生长期,选用3个剂量(30 mJ/cm2、60 mJ/cm2、90 mJ/cm2)进行照射,CCK-8法测定UVA对HaCat细胞增殖活性的影响,qPCR检测HaCat细胞MMP-1 mRNA、MMP-3 mRNA及MMP-9 mRNA的表达水平.采用方差分析,多组均数间两两比较采用q检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 经UVA照射后,HaCaT细胞的增殖受到抑制,照光组和未照光组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).qPCR扩增后显示MMP-1 mRNA、MMP-3 mR-NA及MMP-9 mRNA的表达增加,且以90 mJ/cm2辐照时表达量高.结论 HaCaT细胞经UVA照射后,促进MMP-1 mRNA、MMP-3 mRNA及MMP-9 mRNA的分泌,且与辐照剂量呈正相关.
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水飞蓟素对UVB致人角质形成细胞光老化保护作用的研究
目的:对水飞蓟素中的主要成分水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭的抗细胞光老化作用进行研究.方法:采用UVB辐射HaCaT进行造模并设置空白对照组,运用酶生化法检测水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭对UVB辐射HaCaT后的细胞增殖及抗氧化酶的影响,确定水飞蓟素中抗HaCaT细胞光老化的主要有效成分.结果:与模型组相比,水飞蓟素中的水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭均可增强细胞的增殖活力、提高细胞中SOD的活性、降低MDA的产生和LDH的漏出量.结论:水飞蓟素中的水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭对UVB致人角质形成细胞光老化均具有保护作用,其中水飞蓟宁和水飞蓟亭的抗光老化作用更为显著.
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纳米二氧化硅对人角质形成细胞超微结构的影响
目的:观察纳米二氧化硅(SiO2)颗粒对人角质形成细胞(HaCaT)的影响.方法:将不同浓度的纳米SiO2悬液加入培养的HaCaT细胞中,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中共同孵育4h,收集细胞制样,在透射电镜下观察细胞超微结构的改变.结果:纳米SiO2粒径为40～50nm,在不同浓度下均能进入细胞并对细胞器造成影响,影响的严重程度与纳米SiO2颗粒的浓度呈正相关.结论:纳米颗粒可以通过吞噬作用和直接穿膜两种方式进入细胞,通过其表面能和离子效应影响细胞的超微结构.
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二氧化钛纳米颗粒对人角质形成细胞超微结构的影响及毒性效应
目的:观察无机二氧化钛(TiO2,20～35 nm)纳米颗粒进入人角质形成细胞(HaCaT)后的超微结构变化及毒性效应的影响.方法:将TiO2纳米颗粒与HaCaT细胞共孵育4 h后,收集细胞.采用透射电镜观察TiO2纳米颗粒引起细胞超微结构,变化及在细胞内的分布;采用激光共聚焦扫描显微镜观察TiO2纳米颗粒进入细胞后引起的细胞凋亡和坏死;采用噻唑蓝比色法测定TiO2纳米颗粒对细胞存活的影响.结果:TiO2纳米颗粒通过吞噬方式进入细胞.实验组里TiO2纳米颗粒呈簇状存在于HaCaT细胞内,并使细胞有较大损伤;细胞质有溶解现象,内质网肿胀,线粒体嵴结构紊乱,并肿胀崩解;核周间隙扩大、核固缩.结论:TiO2纳米颗粒具有的毒性效应能够损伤HaCaT细胞超微结构并且抑制细胞的生长.
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他扎罗汀对角质形成细胞增殖周期蛋白Cyclin D1/CDK4/CDK6表达水平的影响
目的:探讨他扎罗汀(Tazarotene)对角质形成细胞增殖周期蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6表达水平的影响.方法:分别以不同浓度的他扎罗汀作用于HaCaT细胞,用CCK-8比色法检测每组细胞在12、24、48和72 h的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,western blot检测周期相关蛋白水平变化.结果:他扎罗汀对HaCaT细胞具有明显的增殖抑制作用(如21.23,P＜0.05),并使G0/G1期细胞比例增加(F=19.83,P＜0.05),周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6的表达水平明显下调.结论:他扎罗汀对HaCaT细胞具有明显的增殖抑制和周期阻滞作用,其作用机制可能与下调Cyclin D1/CDK4/CDK6蛋白复合物的表达有关.
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不同效力糖皮质激素对HaCaT细胞糖皮质激素受体调节的比较
临床上皮肤科医生常根据患者不同的皮损状况选用不同效力的糖皮质激素(glucocorticoid,GC)外用制剂,以达到理想的治疗效果.本课题组前期研究已发现,GC具有下调角质形成细胞糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)α的表达和上调GRβ表达的作用,从而导致外用GC制剂皮肤耐受,疗效降低[1-2].对GC效力等级的判定主要依据其收缩血管作用的强弱而定,那么不同效力的GC外用制剂对角质形成细胞GR表达的调节作用有何差异呢?针对这一问题,本研究以人角质形成细胞为研究对象.观察并比较经不同效力GC作用后人角质形成细胞HaCaT GRα和GRβ的表达情况,希望为临床合理地使用不同效力GC外用制剂提供理论和实验依据.
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荚膜在新生隐球菌对人角质形成细胞黏附与通过细胞层中的作用
原发性隐球菌皮肤感染已经作为独立的疾病在近年来受到了公认[1].荚膜是新生隐球菌目前已知的重要的毒力因子,目前确定了4个独立的荚膜形成相关基因[2].HaCaT细胞是目前应用比较成熟的人角质形成细胞(KC)的体外研究模型.利用这一模型,我们对荚膜在隐球菌对KC的黏附和通过过程中的作用进行了探讨.
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人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞对蛋白激酶C激活的不同生物学效应
细胞信号传导调节通路主要包括蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸激酶等酶系统。它们广泛参与细胞的各种生物学过程如增殖、分化、基因的表达和功能蛋白的合成等[1,2]。PKC是其中重要的调节通路。已发现人角质形成细胞和真皮成纤维细胞中均有PKC的多种亚型，但是对这两种细胞在PKC激活后生物学效应的比较研究甚少。我们通过体外实验，观察了PKC激活剂乙酸肉寇佛泊酯（PMA）刺激后角质形成细胞和真皮成纤维细胞在形态学、细胞增殖以及细胞因子产生等方面的变化，发现这两种细胞在PKC激活后生物学效应存在差异。一、材料角质形成细胞和真皮成纤维细胞来自接受包皮环切的青年男子。细胞培养皿、培养板购自Dako公司，培养基购自Gibco公司，PMA购自Sigma公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Serva公司，前列腺素E1(PGE1)购自Ono公司,白介素(IL)-1α、IL-8检测酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自晶美公司。cAMP检测药盒购自YamasaShoyu公司。
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人参皂苷Rb1与红景天苷对抗皮肤光老化作用的研究
目的:观察人参皂苷Rb1与红景天苷对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)辐照后人角质形成细胞光产物水平的影响及人参皂苷Rb1和红景天苷光保护作用机制.方法:使用含10%小牛血清的RMPI-1640培养液培养人角质形成细胞HaCaT,定量(60 J·cm-2)UVB照射细胞,MTT法检测细胞增殖活性;培养液中加入人参皂苷Rb1和红景天苷,测定UVB照射细胞后细胞中超氧化物岐化酶(SOD)、谷光甘肽(GSH)、氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量的变化.结果:在暴露于UVB后,经人参皂苷Rb1和红景天苷处理,细胞内抗氧化酶SOD、GSH、CAT的活性提高,MDA的产生减少,与未用药组比较差异有统计学意义(均P<0.01).结论:人参皂苷Rb1和红景天苷具有增加人角质形成细胞内抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化反应及抗氧化作用,可以用于对抗皮肤光老化.
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人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养
目的探索用DMEM-SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件. 方法取临床整形外科手术后剩余皮肤,用0.25%的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后,用DMEM-SF完全培养基于5% CO2、37℃培养,绘制生长曲线,并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠-IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定. 结果用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在DMEM-SF培养基中可正常生长2周以上,生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期,第10天进入停滞期.鉴定显示角质形成细胞占95%以上.来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比,细胞生长无统计学差异. 结论用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞,在DMEM-SF完全培养基中生长状况良好,其他细胞污染少,实验成本低廉,操作简单.
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沙棘水提物对UVC辐射HaCaT细胞损伤的保护作用及其机制
目的 探讨沙棘水提物对短波紫外线(UVC)辐射人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用及其机制.方法 体外培养HaCaT细胞株,将其随机分成对照组、UVC模型组、沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组.对照组不加药,不进行UVC照射;UVC模型组去盖置于UVC消毒灯管(30 W,辐射距离70 cm)下进行照射,辐射剂量为20 J/m2,照射30 min;沙棘水提物组分别加入2 、20 mg/mL沙棘水提物5 min后,进行UVC照射,辐射剂量及时间同上.辐射后用PBS洗2遍,换完全培养基继续培养24 h. 观察各组细胞的形态及数量变化,酶标法测定细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力及细胞培养上清液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力,细胞中丙二醛(MDA)含量.结果 对照组细胞形态良好,细胞呈上皮细胞样贴壁生长,细胞呈圆梭形,彼此之间伸出伪足连接,细胞核清晰可见.UVC模型组可见大量细胞碎片,大量细胞凋亡,细胞形态模糊不清,活细胞数明显减少.各沙棘水提物组细胞损伤程度减轻,随着沙棘水提物浓度的升高细胞形态逐渐趋于正常,且凋亡细胞数量逐渐减少,存活细胞数目逐渐增多.与对照组比较,其余各组活细胞数减少(P均＜0.05);与UVC模型组比较,沙棘水提物2 mg/mL组、沙棘水提物20 mg/mL组活细胞数增加(P均＜0.05).与对照组比较,除沙棘水提物20 mg/mL组细胞SOD活力差异无统计学意义外,其余组细胞中SOD、CAT活力及细胞培养上清液中GSH-PX活力均降低,MDA含量升高.与UVC模型组比较,沙棘水提物2 mg/mL、20 mg/mL组细胞中SOD、CAT活力,细胞培养上清液中GSH-PX活力升高,细胞中MDA含量降低(P均＜0.05).结论 沙棘水提物对UVC照射HaCaT细胞造成的损伤具有保护作用,其机制可能与其抗氧化作用及增强细胞生存活力有关.
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人皮肤角质形成细胞库的构建
目的探索人皮肤角质形成细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定技术.方法采用细胞培养技术及免疫组化技术.结果我们采用细胞培养技术体外分离培养了小儿包皮角质形成细胞,传代后的角质形成细胞,经冻存、复苏后,此角质形成细胞仍既能增殖、又能分化,生长状态与新鲜分离的角质形成细胞相类似.结论酶消化法是快速大量培养皮肤角质形成细胞的简便易行的方法.
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白及多糖对氧化损伤的人角质形成细胞JAK/STAT信号通路的影响
目的 探讨白及多糖对氯化钴( CoCl2)诱导人角质形成细胞(HKC)氧化应激形成炎症损伤的JAK/STAT信号通路的保护作用机制.方法 用白及多糖对HKC进行预处理后,用CoCl2处理HKC细胞,建立化学性低氧化剂诱导皮肤细胞氧化应激导致炎症损伤的细胞模型,以噻唑蓝法检测细胞生存活率,用酶联免疫吸附( ELISA)法检测细胞培养液中白细胞介素(IL)-6和IL-8的水平；以ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌量,检测JAK2蛋白的表达.结果 白及多糖提高CoCl2诱导角质形成细胞的存活率具有剂量依赖性.白及多糖高、中剂量组TNF-α、IL-6和IL-8含量与CoCl2对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CoCl2通过产生氧化应激反应导致HKC炎症损伤；白及多糖通过调节JAK/STAT信号通路的JAK2表达水平抑制TNF-α、IL-6和IL-8的释放,可能是其对HKC抗氧化损伤保护作用机制之一.
关键词： 白及多糖 人角质形成细胞 JAK/STAT信号通路 -
阿魏酸对人角质形成细胞的保护作用
目的 探讨阿魏酸对人角质形成细胞(human keratinocytes,HKC)的保护作用及作用机制.方法 用氯化钴(CoCl2)处理HKC,建立氧化应激所致HKC炎症损伤细胞模型,检测阿魏酸预处理HKC后的相关指标,以3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞生存率,用酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测细胞培养液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)的水平.结果 正常对照组HKC细胞生存率100.00%,TNF-α和IL-8含量分别为11.37和98.30 pg·mL-1.0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸处理组中,HKC存活率(分别为96.15%和67.92%)亦显著高于模型组(46.20%,P＜0.01,P＜0.05),该作用呈剂量依赖性; TNF-α含量(分别为12.95和17.46 pg·mL-1)显著低于模型组(29.54 pg·mL-1,P＜0.01,P＜0.05); IL-8含量(分别为102.76和128.96 pg·mL-1)亦显著低于模型组(162.33 pg·mL-1,P＜0.01,P＜0.05).0.003 mg·mL-1阿魏酸对HKC存活率和分泌TNF-α和IL-8无明显影响.结论 阿魏酸可能通过抑制TNF-α和IL-8的释放发挥其对HKC的保护作用.
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"派莎"防晒乳膏对中波紫外线损伤人角质形成细胞的保护作用
目的 探讨"派莎"防晒乳膏对中波紫外线(UVB)损伤人角质形成细胞(HKC)的保护作用及作用机制.方法 用"派莎"防晒乳膏对HKC进行预处理24 h,采用不同强度的UVB 照射体外培养的HKC,24 h 后以噻唑蓝(MTT)法检测细胞生存率,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测上清液中白细胞介素(IL-8)浓度,以酶联免疫吸附实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌量.结果 经UVB照射后,细胞损伤程度与UVB照射剂量有关,"派莎"防晒乳膏可提高UVB照射后HKC的生存率,减少细胞因子TNF-α的分泌.UVB 照射可使HKC 分泌IL-8 增加,"派莎"防晒乳膏组IL-8 浓度与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论 UVB对HKC有损伤作用,且与照射强度相关,"派莎"防晒乳膏对HKC具有光保护作用.抑制TNF-α和IL-8的释放,提高UVB照射后HKC的生存率,可能是其保护作用机制之一.
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白藜芦醇对中波紫外线照射后人角质形成细胞的保护作用
目的 探讨白藜芦醇对中波紫外线(UVB)照射后人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用及其可能机制.方法 运用MTT实验观察0.001～0.5 mmol/L范围内不同浓度的白藜芦醇对HaCaT细胞增殖的影响.采用U-VB(30 mJ/cm2)照射HaCaT细胞后,立即加入不同浓度(0.01,0.1 mmol/L)的白藜芦醇进行干预,同时设空白组与UVB对照组,分别用MTT法检测细胞增殖能力,用羟胺法、比色法、TBA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量,电镜观察细胞超微结构的改变.结果 不同浓度的白藜芦醇作用正常HaCaT细胞后,细胞增殖能力无明显差异(P＞0.05).白藜芦醇能促进UVB照射后HaCaT细胞增殖、增加细胞SOD和GSH-Px活性、降低MDA含量,且高浓度组较低浓度组作用更加显著(P＜0.05).电镜显示白藜芦醇能减轻UVB对HaCaT细胞超微结构的损伤.结论 不同浓度的白藜芦醇对正常HaCaT细胞增殖无明显影响.白藜芦醇在体外对UVB照射后的HaCaT细胞有保护作用,其机制可能与提高氧化酶活性、清除自由基有关.
