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甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定
为了合成甲基对硫磷(M1605)人工抗原,用醋酸-锌粉-盐酸还原甲基对硫磷,制备氨基甲基对硫磷,重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)及中国鲎血蓝蛋白(TTH)偶合,合成人工抗原M1605-BSA、M1605-TTH.M1605-BSA免疫新西兰兔10周后,双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测,证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清,成功地合成了甲基对硫磷人工抗原,为其免疫分析方法的建立提供了条件.
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邻苯二甲酸二环己酯人工抗原的制备研究
目的 合成邻苯二甲酸二环己酯半抗原衍生物和合格的人工全抗原,探讨其制备方法.方法 通过保留环己基结构和在芳环上引入氨基取代基合成了一种邻苯二甲酸二环己酯半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二环己酯,产物经通过1HNMR、IR和UV确证了结构.半抗原衍生物再通过重氮化反应与BSA偶联.结果 得到的半抗原衍生物4-硝基邻苯二甲酸二环己酯的2个紫外吸收峰分别为:λ1=214nm,λ2=256nm;4-氨基邻苯二甲酸二环己酯的2个紫外吸收峰分别为:λ1=226nm,λ2=288nm.人工全抗原4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA,经荧光光谱(λex=307nm,λem=468nm)、体系颜色变化和免疫实验确证偶联成功.抗原结合比为19:1.人工全抗原通过免疫动物得到了效价高、特异性好、纯度也较高的抗体.结论 通过保留环己基结构和在芳环上引入氨基的设计思路可以合成邻苯二甲酸二环己酯的人工全抗原.
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对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定
重氮化法使对氧磷(E600)与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白偶合合成人工抗原.用人工抗原E600-BSA免疫Balb/c小鼠,然后将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞和E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株.并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测.上述杂交瘤细胞连续传代或冻存10周,其分泌抗体水平稳定.
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基于不同载体免疫原制备河豚毒素抗体的研究
目的 比较牛血清白蛋白(BSA)和匙孔型血蓝蛋白(KLH)两种载体蛋白合成的河豚毒素人工抗原的免疫原性,并对其制备的抗体进行研究.方法 用曼尼希法将半抗原河豚毒素(TTX)分别与大分子载体BSA和KLH偶联合成人工抗原TTX-BSA及TTX-KLH,免疫6～8周龄Balb/c雌性小鼠,制备多抗;以卵清白蛋白(OVA)为载体蛋白,同样用曼尼希法制备包被抗原TTX-OVA.TTX-KLH多抗血清同时采用TIX-OVA和TTX-BSA作包被抗原检测,抗血清经间接酶联免疫吸附法(iELISA)以及间接竞争酶联免疫吸附法icELISA)检测.结果 经TIX-KLH免疫获得的多抗血清较TIX-BSA免疫获得的多抗血清特异性高.两种包被抗原的检测效价一致:均为1∶64000,而以TTX-OVA为包被原的检测值稍高,与TTX进行竞争酶联免疫检测,其IC50值波动范围为10～20ng/ml.结论 TTX-KLH具有更好的免疫原性.
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磺胺类药物母核人工抗原的制备研究
目的 合成磺胺类药物共有结构--对氨基苯磺酰胺的衍生物和人工抗原,探讨其制备方法.方法 通过保留对氨基苯磺酰胺结构和在基团上引入羧酸基团,合成了一种对氨基苯磺酰胺的衍生物N-磺胺-4-氨基丁酸,产物经过~1HNMR、~(13)CNMR、IR和ESI-MS确证了结构.衍生物通过活泼酯化法与牛血清白蛋白(BSA)偶联.通过单因素和L9(3~3)正交试验研究了反应物起始摩尔比、半抗原活泼酯化时间和偶联时间等因素对偶联率的影响.终确定活泼酯法佳反应条件为:反应物起始摩尔比50:1;活泼酯化时间6h;偶联时间4h.以佳条件,制备N.磺胺-4-氨基丁酸人工抗原.免疫小鼠,间接ELISA法检测抗血清效价.结果 -N-磺胺-4-氨基丁酸的结构正确,经过紫外光谱检测和免疫动物实验确证人工抗原.结论 N-磺胺4-氨基丁酸人工抗原合成成功.
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苏丹红Ⅰ人工抗原的合成
目的 建立苏丹红I(Sudan I)免疫学检测方法,制备具有免疫原性的苏丹红1人工抗原.方法 采用琥珀酸酐法合成苏丹红I的衍生物苏丹红I-半琥珀酸酯(苏丹红I-HS),在此基础上,采用活性酯法将苏丹红I-HS分别与生血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备得到苏丹红I-HS-BSA和苏丹红I-HS-OVA.结果 采用红外光谱、液质联用对苏丹红I-HS进行分析和鉴定表明合成成功,并用紫外光谱法测定苏丹红I与BSA和OVA偶联比分别为11:1和5:1.结论 苏丹红1人工抗原合成成功.
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丹酚酸B人工抗原的合成与免疫原性研究
目的 制备丹酚酸B(SAB)的人工抗原(SAB-BSA)和包被原(SAB-PLL)并进行鉴定.方法 采用碳二亚胺(EDC)法将SAB分别与牛血清白蛋白(BSA)和多聚赖氨酸(PLL)载体偶联合成SAB-BSA和SAB-PLL;采用紫外分光光度(UV)法和薄层色谱(TLC)法对偶联效果进行鉴定,并通过SAB与BSA的吸光值计算出二者的偶联比;利用获得的SAB-BSA免疫小鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠抗血清内多克隆抗体效价并以间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)检测小鼠抗血清内多克隆抗体的灵敏度.结果 所合成的SAB-BSA为BSA和SAB的结合物,且SAB-BSA中无游离SAB,SAB与BSA偶联成功,SAB-BSA偶联结合比为18∶1;SAB-BSA刺激小鼠产生的针对SAB的多克隆抗体,效价为1∶2×103,该多克隆抗体IC50为17.7 μg/mL.结论 SAB-BSA和SAB-PLL合成成功,可用于SAB单克隆抗体的制备以及SAB快速检测试剂盒的研制.
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天然药物中生物碱类化合物人工抗原的合成及其鉴定方法＊
生物碱是自然界中广泛存在的一类天然含氮有机化合物，具有比较特殊而显著的药理活性。近年来免疫学分析技术常应用于天然药物生物碱的研究，而制备具有良好免疫原性的人工抗原并对其进行鉴定，是建立免疫学分析方法用于生物碱研究的前提和关键。本文主要总结了天然药物中生物碱半抗原与载体蛋白偶联的设计思路及其鉴定方法。
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剑叶龙血素A间接竞争ELISA检测方法的建立
目的:建立间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定剑叶龙血素A(CA)含量.方法:合成半抗原剑叶龙血素A-4'-羧甲基醚(CA-4'-CME),再用碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联制备免疫原(CA-BSA)和包被原(CA-OVA),免疫小鼠制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA法并评估其分析性能.结果:通过紫外扫描分析CA-BSA和CA-OVA的偶联比分别为18∶1和24∶1.抗血清效价高达到12000.用四参数logistic方程拟合CA标准曲线,在分析范围0 ～0.80 mg·L-1内,相关系数(R2)≥0.99,IC500.66 mg·L-1,低检测限0.045 mg·L-1,批内CV≤12.5％,批间CV≤14.7％,回收率92.7％ ～ 118.7％,对5种CA类似物的交叉反应率＜5.38％.此方法检测龙血竭和龙血竭总黄酮中CA含量分别为1.27％,3.08％.结论:剑叶龙血素A间接竞争ELISA法精密度、准确度和特异性均较好,可方便地用于药物检测和分析.
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大黄酸兔源多克隆抗血清的制备与鉴定
目的 合成大黄酸人工抗原,制备敏感性高、特异性强的大黄酸兔源多克隆抗血清.方法 采用碳二亚胺法制备大黄酸人工抗原,将大黄酸分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶联.用紫外扫描法鉴定大黄酸人工抗原是否偶联成功,免疫新西兰兔,制备多抗血清,通过间接竞争ELISA测定抗血清效价,通过间接竞争ELISA鉴定抗血清的敏感性和特异性,并分别用间接竞争ELISA和HPLC检测大黄中大黄酸的含量.结果 2只新西兰兔产生的多抗血清效价在1∶64 000以上,其中,2号兔多抗血清敏感性好,半数抑制浓度为0.09 ng/mL,且具有良好的特异性.兔抗血清测得大黄中大黄酸含量为(0.026±0.001)％,HPLC测得大黄中大黄酸含量为(0.027±0.000)％.结论 本研究制备了敏感性高、特异性强的大黄酸兔源多克隆抗体血清,为建立大黄酸免疫亲和色谱分析技术和快速检测方法奠定了基础.
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芍药苷人工抗原的合成与鉴定
利用高碘酸钠法合成芍药苷免疫抗原PF-BSA和包被抗原PF-OVA,并通过紫外光谱检测芍药苷成功与BSA/OVA偶联.小鼠经PF-BSA免疫后,体内可产生抗芍药苷抗体,酶联免疫分析法分析证明其免疫小鼠所得抗体效价达1:12 800,半数抑制浓度为0.791 mg·L-1,且与黄芩苷等9种中药小分子交叉反应极低.芍药苷人工抗原的合成及抗体的获得为建立ELISA和研制免疫检测试剂盒奠定了基础.
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酸枣仁皂苷A人工抗原的制备及鉴定
采用高碘酸钠氧化法首次合成酸枣仁皂苷A(jujuboside A)人工抗原,利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)鉴定酸枣仁皂苷A人工抗原偶联成功,通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫小鼠血清中抗酸枣仁皂苷A抗体效价及其特异性.竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与酸枣仁皂苷A产生特异性结合,血清抗体效价在1∶4000.成功合成的酸枣仁皂苷A人工抗原,为酸枣仁皂苷A单克隆抗体的制备及研究酸枣仁皂苷A在机体内的药物代谢过程奠定了基础.
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斯皮诺素人工抗原的合成及免疫原性鉴定
采用高碘酸钠法,以BSA,OVA为载体蛋白合成斯皮诺素的免疫抗原和包被抗原,通过紫外扫描法鉴定,偶联率分别为17,13.7.采用间接ELISA和间接竞争ELISA测定小鼠血清,其高效价达1:32000,灵敏度为211.6 μg·L-1且交叉反应率低,表明小鼠经斯皮诺素-BSA免疫后可产生高效价、特异性好的抗斯皮诺素抗体.该实验首次成功制备了具有免疫原性的斯皮诺素人工抗原,为进一步制备斯皮诺素的单克隆抗体及建立斯皮诺素的免疫分析方法提供参考.
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连翘苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定
基于高特异性,高灵敏度的小分子单克隆抗体的免疫分析方法的建立,对中药小分子化合物的的研究具有重要的意义,其中,小分子人工抗原的合成是中药小分子抗体制备的关键步骤.采用高碘酸钠氧化法分别合成连翘苷免疫抗原(FRn-BSA)和包被抗原(FRn-OVA),通过紫外光谱和薄层色谱法检测到连翘苷成功与BSA/OVA偶联,小鼠经FRn-BSA免疫后,体内可产生抗连翘苷抗体,效价在1∶8 000左右,线性范围为1～100 mg·L-1.成功合成的连翘苷人工抗原,可为下一步的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立奠定基础.
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中药有效成分半抗原抗体应用研究进展
中药有效成分半抗原抗体的应用已经触及中药研究的各个领域.首先,可将半抗原单克隆抗体设计成ELISA试剂盒,定量分析牛物样本或植物粗提取物中有效成分的含量,应用于中药质量控制和中药药代动力学的研究.其次,可将半抗原单克降抗体与固相载体相偶联,做成免疫亲和柱,应用于复杂样品的前处理以及knock-out提取物的制备.后,可将有效成分半抗原单克隆抗体单链可变区(scFv)的基因片段导入植物细胞内,基因重组后可得到有效成分高富集的新品种,实现药用植物的分子育种.
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小分子单克隆抗体的制备与敲除技术研究进展
随着单克隆抗体技术应用的愈加广泛,其生产技术也日臻完善.小分子单克隆抗体技术也日益成为人们研究的热点课题.中药小分子单克隆抗体技术的应用也日益广泛,这门技术给中药有效成分的敲除提供有力的技术支持.该文就小分子单克隆抗体制备与敲除技术进行了综述.就其制备过程中的几个步骤,如:半抗原的制备,半抗原与载体偶联,人工抗原的鉴定及偶联比率的测定,动物免疫与单克隆杂交瘤细胞株的建立,单克隆抗体的大规模制备;小分子单克隆抗体的敲除技术的免疫亲和色谱柱的方法进行了详尽的阐述.笔者相信这门技术会使得中药的研究上更高一个层次,并且提高中药研究的国际化水平.
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人工抗原在中药注射剂过敏反应研究中的应用与进展
中药注射剂中存在一些具有潜在致敏性的小分子物质,因相对分子质量太小而缺乏免疫原性,当其与合适的载体偶联后可导致过敏反应.因此,如何将小分子半抗原与载体偶联制备具有免疫原性和反应原性的完全抗原,是中药注射剂小分子致敏物质筛选的关键.作者从中药注射剂半抗原的特点、载体的选择和使用、偶联方法、完全抗原的纯化鉴定等方面论述了人工抗原抗体制备技术的新研究情况及其在中药注射剂致敏物质筛选中的实验研究进展,以及免疫芯片技术在中药注射剂致敏物质研究中的应用前景,旨在为中药注射剂安全性控制提供新的实验研究思路和方法.
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木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定
金银花是常用大宗中药材之一,市场流通量大,但存在较多质量问题,建立一种金银花质量快速检测方法具有重要意义.木犀草苷是其质量控制指标之一,目前木犀草苷的含量检测主要以仪器检测为主,无法满足简单、快速、高通量的需求.酶联免疫检测法(ELISA)则具有灵敏度高、操作简单、设备仪器需求少、通量高等优点,是实现中药材有效成分快速检测的有效手段之一.该研究以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为原料,通过活泼酯法,分别与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原及包被抗原;紫外分光光度法检测半抗原与载体蛋白的偶联比,分别为3.7∶1 (LG-BSA)和1.0∶1(LG-OVA);免疫原(LG-BSA)免疫Bal b/c雌性小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清效价并建立血清特异性标线.结果显示血清效价＞2000,以抗血清建立特异性标线,IC50=298.7 μg·L-,标线范围18.4～4 852.4 μg·L-1,表明所制备的完全抗原免疫原性良好.
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大黄酸人工抗原合成及免疫原性鉴定
大黄药理作用广泛,是临床常用中药材之一.大黄酸是其主要活性成分,大黄酸的含量是大黄质量控制的主要指标之一.目前对大黄酸的检测主要是通过仪器分析手段,如高效液相色谱法,但是仪器分析通常操作繁琐、耗时长、通量小且仪器设备昂贵.与之相比,酶联免疫检测法(ELISA)则具有灵敏度高、操作简单、设备仪器需求少、通量高等优点,是实现中药材快速检测的有效手段之一.该研究制备大黄酸(rhein)人工抗原及血清,为之后大黄酸单克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附检测方法提供基础.通过碳二亚胺法活化大黄酸,分别与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原及包被抗原;通过紫外分光光度法检测人工抗原的半抗原与载体蛋白偶联比,分别为4.0∶1(rhein-BSA)和2.6∶1 (rhein-OVA).用免疫原免疫Bal b/c雌性小鼠,制备抗血清,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗血清效价及特异性.结果表明血清效价均高于8 000,特异性强,免疫原性良好.
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梓醇人工抗原的合成、鉴定及免疫原性的初步研究
基于单克隆抗体的免疫分析方法具有高特异性、高灵敏性等特点,在中药的质量控制和动物体内微量成分的检测等方面均具有重要的意义,该方法建立的前提条件就是成功制备中药活性小分子化合物的人工抗原.该研究采用高碘酸钠氧化法,首次制备了梓醇的人工抗原,通过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和分子排阻色潽法鉴定梓醇与牛血清白蛋白(BSA)偶联成功,用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗梓醇抗体效价在1∶8000以上,成功制备梓醇的人工抗原,为下一步单克隆抗体的制备和相关免疫方法的建立奠定基础.
关键词： 梓醇 人工抗原 免疫分析法 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法 分子排阻色潽法
