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组织工程神经控释系统的理论研究与临床应用
自体神经移植虽然是神经缺损修复的金标准,却由于受到取材的限制,组织工程神经因而成为好的替代选择.组织工程神经控释系统是通过载有生长因子的组织工程神经支架在局部持续不断释放生长因子,在损伤局部形成促进神经再生的微环境,促进神经轴突再生.目前组织工程神经控释系统所用的材料和方法多种多样,每种材料和方法都有自身的优缺点,寻找合适的材料和方法控释生长因子,达到好的神经修复效果,是组织工程神经控释系统研究的主要方向.文章主要探讨近年来一些组织工程神经控释材料在应用方法和技术上取得的新进展,并对其进行归纳总结,按照控释原理进行创新性的分类.
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脱细胞神经支架联合干细胞构建组织工程神经修复坐骨神经缺损的meta分析
背景:研究表明,脱细胞神经支架不仅具有天然神经的空间三维结构,而且具有低免疫原性,但对于长段神经缺损的修复效果仍不理想.为此,有学者将脱细胞神经支架复合种子细胞构建组织工程神经,以提高其治疗效果.目的:系统评价脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞移植修复大鼠坐骨神经缺损的疗效.方法:检索PubMed、The Cochrane Library、EMbase、CNKI、WanFang和VIP数据库,查阅关于脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞修复大鼠坐骨神经缺损的随机对照实验,检索时限均为建库至2016年7月.由3名研究员按纳入和排除标准独立筛选文献、提取数据和评价文献的方法学质量,采用Review Manger5.3软件进行meta分析.结果与结论:终10篇文献纳入研究,共计252只大鼠.Meta分析结果显示:①脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞组的坐骨神经功能指数均优于单纯脱细胞神经支架组:2周[SMD=2.73,95％CI(1.92,3.54),P＜ 0.000 01],4周[SMD=4.57,95％CI(3.43,5.70),P＜ 0.000 01],6周[SMD=1.62,95％CI(0.18,3.06),P=0.03],8周[SMD=4.90,95％CI(2.96,6.84),P＜0.000 01];②术后12周脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞组神经传导速度、潜伏期、振幅优于脱细胞神经支架组:神经传导速度[SMD=1.39,95％CI(0.99,1.78),P＜0.000 01],潜伏期[MD=-0.98,95％CI(-1.19,-0.76),P＜0.000 01],振幅[SMD=1.23,95％CI(0.62,1.85),P＜0.000 1];③脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞组髓鞘厚度均优于单纯脱细胞神经支架组:术后8周髓鞘厚度[MD=0.14,95％CI(0.07,0.21),P＜0.000 1],术后12周髓鞘厚度[SMD=1.85,95％CI(1.63,2.08),P＜0.000 01],术后12周有髓神经纤维数[SMD=3.59,95％CI(2.63,4.55),P＜0.000 01];④术后8周脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞组腓肠肌湿重优于单纯脱细胞神经支架组[SMD=4.22,95％CI(2.40,6.03),P＜0.000 01];⑤当前证据表明,脱细胞神经支架联合间充质干细胞或许旺细胞治疗大鼠坐骨神经缺损较单纯脱细胞神经支架更有助于神经再生和功能恢复.受纳入文献质量的限制,以上结论需更高质量、更大样本的随机对照实验加以验证.
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复合脂肪来源干细胞的脱细胞异种神经联合富血小板血浆修复兔面神经损伤的实验研究
目的 探讨复合脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的脱细胞异种神经联合富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)修复兔面神经损伤的早期效果.方法 取 15 只 3 月龄雌性 SD 大鼠双侧坐骨神经进行脱细胞处理,作为异种神经移植体.取成年新西兰大耳白兔颈背部脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶单独消化法分离培养 ADSCs;兔耳静脉采血后经两步离心法提取 PRP;观察不同体积分数 PRP 对 ADSCs 增殖的影响,以及诱导其为类雪旺细胞可行性.取第 3 代 ADSCs,CM-Dil 活细胞染色剂标记后,荧光显微镜观察细胞标记及传代后荧光衰减情况.另取 32 只新西兰大耳白兔建立左侧面神经 1 cm 长缺损模型,随机分成 4 组(n=8),A、B、C、D组分别采用 CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经+自体PRP、CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经、脱细胞异种神经、自体神经移植修复神经缺损.术后 1、8 周静态下测量各组动物左侧上唇与面正中线成角(θ 角);4、8 周神经电生理检测记录神经传导速度;8 周荧光显微镜观察 A、B 组再生神经远近端 CM-Dil-ADSCs 数量,各组再生神经甲苯胺蓝染色计数有髓神经纤维、透射电镜观察再生神经纤维结构.结果 5％～20％ PRP 均能促进 ADSCs 增殖,经 20％ PRP诱导后细胞 S-100 免疫荧光染色呈阳性.ADSCs 经 CM-Dil 标记后荧光显微镜下观察示细胞标记率达90％ 以上,被标记细胞传代后细胞增殖良好,传代后荧光稍衰减.术后各组动物均存活至实验完成.术后 1 周各组动物面部均发生不同程度功能障碍,A、B、C、D 组左侧 θ 角分别为(53.4±2.5)、(54.0±2.6)、(53.7±2.4)、(53.0±2.1)°,均显著低于健侧(P<0.05);术后 8 周分别为(61.9±4.7)、(56.8±4.2)、(54.6±3.8)、(63.8±5.8)°,与健侧及术后 1 周比较差异均有统计学意义(P<0.05).大体观察各组动物再生神经完整性及连续性均良好.术后 4、8 周神经电生理检测示,A、D 组神经传导速度均显著快于 B、C 组,B 组快于 C 组(P<0.05),A、D 组间比较差异无统计学意义(P>0.05).术后 8 周荧光显微镜观察示,A 组移植神经远、近端横断面均可见大量 CM-Dil-ADSCs通过,B 组通过细胞相对较少.甲苯胺蓝染色示,A、D 组有髓神经纤维密度均显著高于 B、C 组,B 组高于 C 组(P<0.05);A、D 组间差异无统计学意义(P>0.05).透射电镜观察示,D 组有髓神经纤维鞘直径大、壁厚,形态规则;A 组髓鞘形态与 D 组相似;B、C 组髓鞘形态不规则,直径小、壁薄.结论 ADSCs 可以作为种子细胞在体内存活,并可在 PRP 诱导下分化为类雪旺细胞,与脱细胞异种神经复合后修复兔周围神经损伤可获得较好效果.
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脐血间充质干细胞诱导分化为类雪旺细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究
目的 评价将人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)来源的类雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为种子细胞,修复大鼠坐骨神经15 mm缺损的效果,为hUCBMSCs应用于临床治疗周围神经缺损提供实验依据.方法 SPF级3月龄雄性SD大鼠45只,体重200 ～ 250 g.取新生儿脐带血,淋巴细胞分离液复合高分子量羟乙基淀粉分离培养hUCBMSCs并鉴定;取第3代hUCBMSCs,采用改良化学诱导法联合细胞因子方法诱导分化培养类SCs并鉴定.取15只SD大鼠坐骨神经,采用液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管作为支架材料;将密度1×107个/mL的类SCs细胞悬液多点注射至该支架内复合培养7d构建组织工程神经.取SD大鼠30只制备长约15 mm坐骨神经缺损动物模型,根据缺损神经修复方法不同,实验分为A、B、C3组(n=10),A组采用组织工程神经缝合,B组采用未复合类SCs的去细胞神经基膜管缝合,C组采用自体坐骨神经原位缝合.术后行大体观察、坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI)测定、神经电生理功能检测、腓肠肌湿重测定、Masson染色评价神经修复情况.结果 分离培养的hUCBMSCs高表达MSCs表面标志;诱导培养后类SCs经免疫细胞化学染色检测示神经胶质细胞标志物S100b、胶质纤维酸性蛋白、P75表达呈阳性.术后8周,大体观察示A组组织工程神经管壁无坏死及液化,周围轻度粘连,吻合处连续性较好;B组支架外观与A组相似;C组自体神经周围粘连较A、B组轻,吻合口光滑,无明显膨大,颜色与正常神经相似.各组大鼠术后SFI随时间延长呈逐渐降低趋势,C组SFI恢复优于A、B组,A组优于B组(P＜0.05).术后各组大鼠远端吻合口处均可检测到神经复合动作电位,波幅及传导速度C组均优于A、B组,A组优于B组(P＜0.05).术后各组大鼠实验侧小腿腓肠肌与健侧相比,均发生不同程度萎缩;腓肠肌湿重恢复率C组优于A、B组,A组优于B组(P＜0.05).Masson染色示A组可见大量再生神经纤维,有髓神经纤维排列较为整齐、致密,纤维直径相似;C组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径均明显多于A、B组,A组多于B组(P＜0.05).结论 hUCBMSCs来源的类SCs能够促进大鼠15 mm坐骨神经损伤修复可作为组织工程神经种子细胞来源.
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PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架材料的制备及细胞相容性研究
目的 探讨PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备方法 及细胞相容性. 方法 采用静电纺丝法制备PLGA-丝素.胶原(实验组)及单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架,扫描电镜观察两组支架材料,测定支架纤维直径、孔隙率、吸水率及抗拉强度.取8只SD近交系乳鼠双侧臂丛神经及坐骨神经,分离培养SC,S-100免疫组织学观察并测定SC纯度.取第4代SC以5 × 104个/mL分别与25%、50%及100%浓度的两组支架浸提液进行培养,以DMEM培养作空白对照组.培养1、3、5、7 d采用MTT法测定吸光度(A)值.将第4代SC以5×104个/mL密度分别接种至PLGA-丝素-胶原(实验组)和单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架支架复合培养.复合培养2、4、6 d行扫描电镜观察,另于4 d行激光扫描共聚焦显微镜观察SC在材料上生长情况. 结果 扫描电镜观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构.实验组和对照组纤维直径分别为(141±9)um和(205 ±11)nm;支架内孔洞相互连通,孔隙率分别为87.4%±1.1%和85.3%±1.3%;吸水率分别为2 647%±172%和2 593%±161%;抗拉强度分别为(0.32 ±0.03)MPa和(0.28 ±0.04)MPa;两组比较差异均有统计学意义(P<0.05).S-100免疫组织化学染色显示SC纯度为96.5%±1.3%.MTT检测SC在不同浓度实验组及空白对照组中生长良好,A值均随时间延长而增大,同组各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间点各浓度实验组及空白对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察显示,实验组SC在支架上生长良好,4 d轴突连接,6 d后大量增殖,基质分泌;生长情况优于对照组.复合培养4 d激光扫描共聚焦显微镜观察结果 与扫描电镜一致. 结论 采用静电纺丝方法 制备的PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架安全无毒,具备合适的孔径和孔隙率,适合SC生长,细胞相容性良好,是一种组织工程神经良好的支架载体.
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bFGF-PLGA缓释微球生物活性组织工程神经的构建和效果评价研究
目的 探讨应用SC、ECM凝胶、bFGF-PLGA缓释微球、PLGA纤维微丝整合至高渗透性聚乳酸[poly(D,L-lacitic acid),PDLLA]导管中,构建组织工程神经的方法,并评价其修复周围神经缺损的效果.方法 培养和纯化1 d龄SD近交系乳鼠SC,取第1代细胞(1 x 107个/mL)与bFGF-PLGA缓释微球、ECM凝胶复合,注入内置PLGA纤维微丝的高渗透性PLLDA导管中,构建组织工程神经.取成年SD大鼠60只,制备坐骨神经15 mm缺损模型后,根据移植物不同随机分为5组(n=12).A组:采用自体神经移植修复;B组:PDLLA导管,管内注满PBS液;C组:含PLGA纤维微丝的PDLLA导管,管内注满30%ECM凝胶;D组:含PLGA纤维微丝的PDLLA导管,管内注满30%ECM凝胶与SC的混合物;E组:组织工程神经.术后观察大鼠一般情况,于术后12、16、20及24周行坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI)测定,术后12及24周神经电生理检测,并取材行大体观察和组织学观察.结果 术后大鼠均存活至实验完成.术后12、16周,E组SFI与B组差异有统计学意义(P＜0.05);术后20、24周,E组与B、C组差异有统计学意义(P＜0.05).术后12周,电生理检测E组坐骨神经传导速度(nerve conduct velocity,NCV)大于B、C组(P＜0.05),复合动作电位振幅(compound amplitude,AMP)和动作电位面积分数(action potential area,AREA)大于B、C及D组(P＜0.05):术后24周,E组NCV、AMP和AREA大于B、C组(P＜0.05).组织学观察术后12周,E组再生神经组织面积及有髓神经纤维数与A、B、C组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);有髓神经纤维密度和直径小于A组(P＜0.05),大于B、C、D组(P＜0.05).术后24周,E组再生神经组织面积大于B组(P＜0.05),有髓神经纤维数与A、B、C组比较有统计学意义(P＜0.05);有髓神经纤维密度和直径大于B、C组(P＜0.05).结论 SC、ECM凝胶、bFGF-PLGA缓释微球、PLGA纤维微丝与高渗透性PDLLA导管相互整合构建的组织工程神经修复神经缺损后,能促近神经再生,修复效果接近于自体神经移植.
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经等离子体修饰并复合BMSCs的组织工程神经研究
目的 探讨经等离子体修饰的PLGA神经导管复合BMSCs后修复大鼠坐骨神经缺损的疗效.方法 取30只新生SD大鼠股骨及胫骨骨髓,培养获得原代BMSCs,并传至第3代.将PGA和PLA按90:10摩尔比例混合,制备PLGA神经导管,对其进行等离子体修饰.取30只4周龄SD大鼠,制备右后肢坐骨神经1 cm缺损模型.按修复材料不同随机分成3组(n=10),实验组:第3代BMSCs复合经等离子体修饰PLGA神经导管;对照组:第3代BMSCs复合普通PLGA神经导管;自体组:自体神经.术后6周观察大鼠的行走步态变化,测定坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI)、电生理变化、腓肠肌湿重恢复率,采用再生神经轴突图像分析评价神经修复效果.结果 术后大鼠均存活至实验完成.术后6周,实验组和自体组大鼠行走步态恢复情况较对照组好.实验组、对照组及自体组SFI分别为-51.02±6.54、-58.73±7.87及-48.73±3.95,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组运动神经传导速度及波幅明显高于对照组(P＜0.05),但与自体组差别不明显(P＞0.05),对照组与自体组差异有统计学意义(P＜0.01).实验组、对照组及自体组腓肠肌湿重恢复率分别为56.13%±4.27%、43.14%±6.52%、59.47%±3.85%,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度均高于对照组(P＜0.05),低于自体组(P＜0.05);对照组与自体组差异有统计学意义(P＜0.01).结论 复合BMSCs的等离子体PLGA神经导管能有效促进周围神经的再生,为研制新型的组织工程神经修复周围神经缺损提供新的思路.
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雪旺细胞和生物蛋白胶构建组织工程神经的初步研究
目的 研究雪旺细胞-生物蛋白胶复合物构建组织工程神经,修复周围神经缺损的效果.方法 取4周龄新西兰兔瓦勒变性坐骨神经,采用组织块反复种植培养法培养雪旺细胞,分离纯化,并用S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定.收集已纯化的雪旺细胞,配制成1×106/ml的细胞悬液,加入生物蛋白胶制成雪旺细胞-生物蛋白胶复合物,倒置相差显微镜观察雪旺细胞生长情况.将雪旺细胞-生物蛋白胶复合物填充于硅胶管(A组)和生物膜(B组)内,构建组织工程神经,分别移植桥接修复2月龄新西兰大白兔左侧10 mm胫神经缺损(n=8);C组(n=8)作自体神经移植.术后10周,行实验动物大体观察、神经电生理检测、移植体大体解剖和组织学观察.结果 所有动物均存活至实验完成.术后3～4周A组所有动物左侧足底均出现溃疡,B、C组小部分动物出现足底溃疡.10周,神经电生理检测发现A组所有神经移植体未能传导电刺激;B、C组所有移植体均能传导电刺激引起腓肠肌的动作电位,两组动作电位振幅和神经传导速度分别为4.21±0.82 mV、33.40±5.40 m/s和4.80±1.15 mV、36.55±6.43 m/s,差异均无统计学意义(P＞0.05).A组所有神经移植体内未见神经纤维长入,两端均有神经瘤形成;B、C组无明显神经瘤形成,B组整段神经移植体内有神经纤维长入.组织学观察示B、C组再生神经的新生轴突形态无明显区别,均接近正常神经组织.结论 用生物膜包裹雪旺细胞-生物蛋白胶复合物,构建组织工程神经,能够促进神经再生,其修复效果接近于自体神经移植,具有临床应用前景.
关键词： 组织工程神经 雪旺细胞-生物蛋白胶复合物 周围神经 再生 兔
