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脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对BeWo细胞炎症与凋亡相关基因表达的影响
目的 观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)暴露对人胎盘绒毛癌细胞(BeWo细胞)炎症与凋亡相关基因表达的影响.方法 将BeWo细胞进行培养和相应剂量(0 ～ 750 nmol/L) DON暴露,ELISA法检测人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平,qPCR法检测基因白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、环氧酶(Cox)-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和B淋巴细胞瘤(Bcl)-xl的表达水平.结果 与空白对照组相比,50 nmol/L DON暴露组炎症和凋亡相关基因的表达呈显著性改变,即炎症相关基因IL-6、TNF-α和Cox-2在3、12和24 h时表达均显著上调(P＜0.01),而IL-8仅在暴露24 h时显著上调(P＜0.01),而凋亡相关基因Caspase-3在3、12和24 h时表达均显著低于对照组(P＜0.01),而Bcl-xl的表达在暴露24 h时显著高于对照组(P＜0.01).结论 BeWo细胞DON暴露时炎症反应增强,凋亡被抑制,推测以上结果可能是DON胚胎发育毒性的潜在分子机制之一.
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不同缺氧方法诱导BeWo细胞缺氧诱导因子1α表达的实验研究
[目的]探讨用于滋养细胞缺氧研究的缺氧方法及滋养细胞模型.[方法]滋养细胞来源的BeWo细胞系,分4组培养:正常对照组、低氧浓度组、二氯化钴组和去铁敏组.培养48 h后收集细胞,应用实时定量PCR方法,检测BeWo细胞HIF-1α mRNA表达水平;应用Western blot方法,检测BeWo细胞HIF-1α蛋白的表达水平.[结果]与正常对照组相比,低氧浓度组、二氯化钴组和去铁敏组的HIF-1α蛋白和mRNA表达均明显升高;与低氧浓度组比较,二氯化钴组和去铁敏组HIF-1α蛋白和mRNA表达水平无明显差异.[结论]环境缺氧和细胞缺氧均可诱导BeWo细胞HIF-1α的表达,二氯化钴或去铁敏可以作为缺氧方法用于滋养细胞缺氧方面的研究,BeWo细胞也可作为一种细胞模型用于HIF-1α表达的研究.
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滋养细胞分泌14-3-3 τ蛋白对子宫内膜基质细胞表达整合素αvβ3蛋白的影响
目的 探讨滋养细胞分泌14-3-3 τ蛋白对子宫内膜基质细胞容受性分子整合素αvβ3表达的影响.方法 RNA干扰技术下调人绒癌滋养细胞株BeWo细胞14-3-3 τ蛋白的表达.Western blot法检测BeWo细胞及培养液中14-3-3 τ蛋白的表达.建立14-3-3 τ蛋白表达下调的BeWo细胞与人子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESC)的共培养体系,Western blot法检测共培养体系培养液中14-3-3 τ蛋白的表达,以及ESC容受性分子整合素αvβ3的表达变化.结果 与siRNA阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调BeWo细胞和培养液中14-3-3 τ蛋白的表达(P<0.05).共培养体系中,与siRNA阴性对照组相比,与14-3-3 τ蛋白表达下调的BeWo细胞共培养的ESC整合素αvβ3的表达显著上调(P<0.05),提示ESC容受性增加.与单独培养的ESC相比,培养液中添加14-3-3 τ重组蛋白的ESC培养24 h后整合素αvβ3的表达显著下调(P<0.05),提示ESC容受性降低.结论 14-3-3 τ蛋白可以被滋养细胞分泌至细胞外,并可能发挥调控ESC容受性的作用,但其作用机制仍需进一步研究.
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基于代谢组学方法研究生半夏和姜半夏对BeWo细胞的毒性机制
目的 通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析生半夏和姜半夏干预后细胞内代谢物改变,来评价生半夏和姜半夏潜在的发育毒性.方法 采用胎盘组织来源的BeWo细胞系构建体外胎盘模型,运用GC-MS检测细胞经生半夏及姜半夏干预后细胞内所含代谢物及其相对含量的变化.结果 细胞代谢物中共鉴定出甘氨酸、氨基丙二酸、脯氨酸、葡萄糖、半乳糖、硬脂酸在、肌醇等九种差异性代谢物.结论 运用GC-MS代谢组学技术评价半夏及姜半夏的发育毒性具有可行性.
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AngⅡ对体外培养绒癌BeWo细胞株分泌sFlt-1蛋白的影响
目的 进一步探讨肾素-血管紧张素系统(RAS)在子痫前期发病中的作用及机制.方法 将体外培养的绒癌BeWo细胞株随机分为四组,其中A组加入95%hamF-12培养液,B、C、D组分别加入血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、缬沙坦及AngⅡ+缬沙坦,培养72 h后收集培养基上清液,用ELISA法检测可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)蛋白表达情况.结果 A、B、C、D组血清sFlt-1蛋白分别为(245.76±26.09)、(365.56±30.55)、(259.31±15.42)、(268.53±23.79)pg/ml,B组显著高于其他三组(P均<0.05).结论 RAS激活在子痫前期发病中具有重要作用,上调sFlt-1蛋白水平可能为机制之一;此为临床防治有关母婴并发症提供了理论依据.
关键词： 子痫前期 可溶性血管内皮生长因子受体-1 BeWo细胞 血管紧张素Ⅱ -
低氧对BeWo细胞骨桥蛋白表达的影响
目的 体外模拟子痫前期胎盘缺氧的低氧环境培养滋养细胞,研究低氧对滋养细胞骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达的影响,以进一步深入研究OPN在子痫前期发病机制中的作用.方法 利用气体混配缺氧装置(QT-MTX-3)模拟子痫前期的发生发展过程,配置不同氧浓度,采用细胞免疫组化和实时荧光定量PCR检测人胎盘绒毛膜癌滋养细胞系BeWo细胞在不同氧浓度下OPN蛋白及其mRNA的表达.结果 ①在不同氧浓度的环境下,显微镜观察BeWo细胞的生长情况,发现其对低氧反应敏感,细胞形态发生明显的改变.②细胞免疫组化检测结果显示:OPN在各组BeWo细胞中均有表达,其免疫反应产物主要表达定位于胞质和胞膜中;缺氧24 h各组的OPN蛋白表达无明显变化;但低氧48 h后,低氧组OPN蛋白的表达水平均明显下降,且2%O2组OPN蛋白下降更显著.③实时荧光定量PCR检测结果表明低氧对滋养细胞OPN mRNA的表达影响呈现出浓度时间依赖性,即随着氧浓度的降低和低氧时间的延长,OPN mRNA的表达呈显著下降趋势.结论 低氧使BeWo细胞OPN的表达降低,且呈浓度时间依赖性,类似于OPN在子痫前期胎盘组织的表达随病情加重而进一步降低,这可能是子痫前期胎盘中缺氧对滋养细胞功能影响的重要机制之一.
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骨桥蛋白在缺氧对滋养细胞侵袭力影响机制中的作用
目的 研究不同氧浓度下滋养细胞骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达与相应氧浓度下滋养细胞侵袭力的相关性,探讨OPN在缺氧对滋养细胞侵袭力影响机制中的作用.方法 利用气体混配缺氧装置(QT-MTX-3),模拟子痫前期胎盘缺氧的低氧环境,培养人胎盘绒毛膜癌滋养细胞系BeWo细胞.采用Western 印迹和实时荧光定量PCR方法,检测不同氧浓度对BeWo细胞OPN表达的影响.采用Transwell侵袭模型,探讨缺氧对BeWo细胞侵袭力的影响.结果 Western blot检测结果显示,缺氧48 h后,低氧组OPN蛋白的表达水平均明显下降,且2%O2组OPN蛋白下降更显著.实时荧光定量PCR检测结果表明,缺氧对滋养细胞OPN mRNA的表达影响呈现出浓度时间依赖性,随着氧浓度的降低和缺氧时间的延长,OPN mRNA的表达呈显著下降趋势.Transwell侵袭实验结果显示,与常氧对照组相比,低氧组细胞侵袭力明显降低,8%O2组和2%O2组的细胞浸润指数分别为0.298 8和0.091 7(P＜0.01).采用Spearman相关分析法,比较OPN表达水平与BeWo细胞侵袭力的相关性,结果显示,随着OPN表达的降低,滋养细胞的侵袭力进一步下降,OPN表达水平与侵袭指数成正相关(rs=0.944,P＜0.01).结论 缺氧降低滋养细胞OPN的表达,表现为浓度和时间依赖性;随着OPN表达的降低,滋养细胞的侵袭力下降.OPN低表达可能是子痫前期滋养细胞侵袭力下降的分子机制之一.
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乙型肝炎病毒感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞体外培养模型的建立
目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)感染人绒毛膜癌滋养层细胞(BeWo)体外培养模型,探讨HBV官内感染机制.方法 应用高病毒载量的HBV阳性血清感染BeWo细胞并传代,应用实时荧光定量聚合酶链反应( PCR)技术检测感染初代细胞和传代细胞内以及上清液中HBV DNA量；应用化学发光微粒子免疫法检测感染后初代细胞和传代细胞的上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)量；应用SABC免疫组化检测感染细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的表达.结果 感染初代各时间点细胞内和上清液中HBVDNA量随时间延长而增加,120 h HBV DNA量高；传代细胞内和上清液中HBV DNA量随传代次数增加逐渐降低,5代后检测均为阴性.感染初代各时间点细胞的上清液中HBsAg量随时间延长而增加；传代细胞的上清液中HBsAg量在1～3代为阳性,但量逐渐降低,4代后均为阴性.感染初代各时间点细胞和传代细胞的上清液中HBeAg量均为阴性；1～3代细胞HBsAg、HBcAg染色可见阳性细胞.结论 HBV可以感染BeWo细胞,且能在传代细胞中表达；BeWo细胞可用于HBV宫内感染机制的研究.
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HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达
目的 构建乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 用PCK方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并将该裁体转染Bewo细胞,72 h后,用Western 免疫印迹和微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBeAg蛋白在胞内和上清中的表达.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达HBeAg,并可分泌HBeAg.结论 构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,为研究胞内HBeAg对Bewo细胞Toll样受体表达的作用奠定了基础.
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DMT1在人胎盘绒毛膜癌细胞中表达的实验研究
目的 进一步确定二价金属离子转运体1(DMT1)在人胎盘绒毛膜癌细胞(BeWo)中的表达定位,以及缺铁状态下mRNA的表达变化.方法 采用免疫细胞化学技术观察DMT1在BeWo细胞中的表达定位,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测DMT1在BeWo细胞缺铁状态下mRNA的表达变化.结果 DMT1在BeWo细胞中呈阳性表达,其弥漫性表达定位于细胞质和细胞膜上;DMT1 +IRE mRNA和DMT1-IRE mRNA的相对表达量随缺铁干预浓度和时间的增加而上调.DMT1+IRE mRNA的相对表达量高于DMT1-IRE mRNA.结论 DMT1大量表达在BeWo细胞质和细胞膜上,且表达受机体不同铁水平的调节,说明其在胎盘铁转运过程中发挥重要作用,为进一步探讨胎盘铁转运分子机制提供实验基础.
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1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达
目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.
关键词： 乙型肝炎病毒 1.3倍HBV基因组 真核表达载体 BeWo细胞 -
Toll样受体2在人绒毛外滋养细胞和绒癌细胞中的表达及意义
目的 通过体外实验研究Toll样受体2(TLR2)在人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1及绒癌细胞株BeWo中的表达,初步探讨TLR2在绒癌发生发展中的作用和意义.方法 体外培养TEV-1及BeWo细胞株,RT-PCR检测其TLR2 mRNA表达水平;免疫细胞化学检测TLR2蛋白的定位和半定量表达.结果 (1)TEV-1及BeWo细胞均表达TLR2,且定位于细胞膜和细胞浆.(2)TLR2的mRNA及蛋白表达水平在BeWo细胞明显高于TEV-1细胞(P<0.05).结论 BeWo细胞明显高表达的TLR2可能与绒癌的发生、发展、转移和免疫耐受有关.
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Toll样受体4介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒的复制
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响. 方法 首先用TLR4配体LPS处理Bewo细胞,观察细胞TLR4 mRNA表达的动力学.然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1 (+)-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以LPS处理3d.后,用抗TLR4处理Bewo细胞1h后,加入10μg/ml LPS刺激.采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR4 mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平.结果 LPS可显著诱导Bewo细胞TLR4 mRNA表达(P＜0.05),呈时间和剂量依赖性；与对照组比较,LPS可显著抑制HBV复制(P＜0.001),LPS对HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制率(％)分别为29.70±6.03、32.12±5.98和33.89±1.28.抗TLR4可显著逆转LPS对HBV复制的抑制作用(P＜0.01). 结论 TLR4介导的天然免疫可一定程度地抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径.
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双特异性磷酸酶5对人胎盘滋养层细胞系BeWo增殖和凋亡的影响
目的 探讨双特异性磷酸酶5 (dual specificity phosphatase 5,DUSP5)基因过表达对人胎盘滋养层细胞系BeWo增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 以携带人DUSP5基因的重组慢病毒感染BeWo细胞,用流式细胞仪分选建立过表达DUSP5的BeWo细胞模型,以携带空载体的慢病毒感染的细胞以及未经任何处理的细胞作对照.经荧光实时定量PCR和Western blot检测DUSP5基因mRNA和蛋白的表达,经CCK-8实验和流式细胞术检测BeWo细胞增殖和凋亡的变化,经Western blot检测磷酸化ERK(p-ERK)、p-p38及p-JNK的变化.结果 ①经荧光实时定量PCR和Western blot证实,成功构建了DUSP5过表达的人胎盘滋养层细胞BeWo细胞模型;②CCK-8实验结果显示DUSP5过表达组在第3、4、5天的光密度值D(490)与其他两对照组相比明显增高(P＜0.01);流式细胞仪结果显示顺铂作用48 h后,DUSP5过表达组与空病毒载体组相比,正常细胞的百分比显著增加而早期凋亡细胞百分比则显著减少(P ＜0.01);Western blot结果显示DUSP5过表达组中p-ERK1/2水平显著下降,而p-p38和p-JNK未见明显变化.结论 DUSP5可促进人胎盘滋养细胞系BeWo增殖、抑制细胞凋亡,以上作用可能与DUSP5抑制ERK信号通路有关.
关键词： 双特异性磷酸酶5 BeWo细胞 细胞增殖 细胞凋亡 ERK1/2信号通路 -
Vaspin、IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中的表达
目的 测定妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus ,GDM)及正常妊娠妇女胎盘组织中丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)及白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的表达,观察IL-6对BeWo细胞vaspin表达的影响,探讨vaspin、IL-6在GDM中的作用及相互关系.方法 选择2012年10月至2013年10月于河北省人民医院行择期剖宫产术57例孕妇,根据孕妇有无GDM分为GDM组(30例)和正常妊娠( normal glucose tolerance,NGT)组(27 例).取两组孕妇胎盘组织,实时荧光定量反转录PCR 测定胎盘组织vaspin、IL-6 mRNA表达水平,免疫蛋白印迹法检测胎盘组织vaspin及IL-6蛋白的表达水平;用不同浓度的IL-6分别与BeWo细胞共培养,留取细胞,测定BeWo细胞vaspin mRNA和蛋白表达水平.结果 GDM组胎盘组织vaspin mRNA及蛋白表达水平与NGT组比较[(0.60 ±0.32) vs (0.68 ±0.32); (0.30 ±0.08 ) vs (0.39 ±0.26 )],差异无统计学意义(P＞0.05);IL-6 mRNA及蛋白表达水平高于NGT组[(1.35 ±0.67 ) vs (0.82 ±0.47 );(1.23 ±0.25) vs (0.54 ±0.20)](P＜0.05);GDM组胎盘组织vaspin mRNA和蛋白表达与新生儿体质量呈负相关(r＝-0.59、-0.88, P＝0.01、＜0.01).不同浓度的IL-6均可抑制BeWo细胞vaspin mRNA及蛋白表达.结论 vaspin与GDM的发生有关,并参与胎儿生长发育;IL-6可能参与了vaspin的调控.
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缺氧对BeWo细胞系中缺氧诱导因子2及其靶基因VEGF表达的影响
目的:探讨缺氧对体外培养的BeWo细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,以及应用反义寡核甘酸封闭缺氧诱导因子2α (HIF-2α)后,VEGF表达的变化.方法:将BeWo细胞分4组进行体外培养:常氧组、缺氧组、HIF-2α正义组和HIF-2α反义组.检测HIF-2α蛋白、HIF-2α mRNA和VEGF mRNA表达.结果:与常氧组相比,缺氧组的HIF-2α蛋白、mRNA、VEGF的mRNA水平均升高;与缺氧组相比,反义组的HIF-2α蛋白、HIF-2α mRNA、VEGF mRNA表达均降低.结论:缺氧可诱导BeWo细胞中VEGF的表达,这种作用可能是通过HIF-2介导的.
