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扩展青霉碱性脂肪酶结构基因的克隆与原核表达
目的 克隆并原核表达扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)结构基因.方法 提取扩展青霉总RNA,经RT-PCR扩增PEL结构基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-PEL,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,包涵体蛋白经变性、复性后,采用NaOH滴定法测定其酶活性.结果 经RT-PCR扩增获得约780 bp的PEL结构基因;所构建的重组表达质粒pET-28a-PEL经酶切及PCR鉴定正确;目的蛋白的相对分子质量约为28 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;发酵液及复性的包涵体蛋白酶活性可达12.44 U/ml.结论 已成功克隆并原核表达了PEL结构基因,为获得碱性脂肪酶高产基因工程菌株奠定了基础.
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南极产低温脂肪酶菌株Psychrobacter sp. 7195的选育、发酵条件及酶学性质研究
从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株7195,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明该菌株属于嗜冷杆菌属 (Psychrobacter). 生长特性研究表明该菌株属于耐冷菌,其适生长温度范围为5～15°C, 7195菌株能利用多种碳、氮源产酶.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52 柱层析进行初步分离纯化后进行酶学性质的研究. 该菌株所分泌的脂肪酶适作用温度为30°C,适pH值为9.0,对热敏感,60°C热处理10min剩余酶活为30%,是典型的低温酶. Ca2+、Mn2+、Cu2+对该酶有较为明显的激活作用,而Co2+、Zn2+、Hg2+、Rb2+、Cd2+、Fe3+、EDTA则能抑制酶活,此外该脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS、Triton X-100、Tween 80、Tween20等变性剂中表现出较好的稳定性.
