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腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞的生长抑制作用
目的 在本室已构建Ad.RGD空载体和Ad.RGD-ING4腺病毒基础上,再构建Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53单双基因重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞的生长抑制作用.方法 PCR克隆P53基因,构建pAd.RGD-P53和pAd.RGD-ING4-P53同源重组腺病毒质粒,用QBI-293A细胞进行包装扩增和检测效价.将Ad.RGD、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-P53、Ad.RGD-ING4-P53分别感染A549细胞后,流式细胞仪检测各组重组腺病毒对A549细胞的感染效率.Western blotting检测A549和PC-9细胞中ING4或/和P53蛋白的表达.MTT法检测A549细胞生长,流式细胞仪检测各组A549和PC-9细胞的凋亡率.real-time PCR检测A549细胞内凋亡相关基因Caspase-3、BAX及BCL-2 mRNA的表达水平.结果 PCR和酶切鉴定结果表明:成功构建了pAd.RGD-P53和pAd.RGD-ING4-P53同源重组腺病毒质粒,包装扩增后经效价检测可达1×109 ～1×1010 pfu/mL;各组重组腺病毒感染A549细胞后,感染效率可达90％～95％.Western blotting检测结果表明ING4或/和P53蛋白可在A549和PC-9细胞中成功表达.MTT法检测发现ING4或/和P53单双基因重组腺病毒均能明显抑制A549细胞生长,流式细胞仪检测表明ING4或/和P53基因表达均可诱导A549和PC-9细胞凋亡,且Ad.RGD-ING4-P53双基因重组腺病毒组较Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组更为明显(P＜0.05).real-time PCR检测表明腺病毒介导的ING4或/和P53基因表达能够上调A549细胞内Caspase-3、BAX mRNA表达,下调BCL-2 mRNA的表达,且双基因组较单基因组更为明显(P＜0.05).结论 成功构建了Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53重组腺病毒.各重组腺病毒目的基因表达均能明显抑制人肺腺癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,且双基因组较单基因组效果更优,其分子机制可能与细胞内凋亡相关基因Caspase-3、BAX表达上调及BCL-2表达下调有关.
