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荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒研究
目的:探讨乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA量之间的关系,分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用.方法:应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)分别检测165例乙型肝炎患者血清的血清标志物和病毒DNA量.结果:以大于5×102拷贝数为阳性,HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组合里检出率为91%;HBsAg、HbeAb、HbcAb阳性组合里检出率为60%;HbsAg、HbcAb阳性组合里检出率为71%;HBsAg阳性组里检出率为38%;HBcAb阳性组里检出率为9%;HBsAb、HBeAb、HbcAb阳性组合里检出率为10%.结论:FQ-PCR直接检测HBV DNA是HBV复制可靠指标,有助于疾病的诊断及预后判断.
关键词： 乙型肝炎 酶联免疫吸附实验 荧光定量聚合酶链式反应 -
荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究
目的评价荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测恶性疟原虫的效果.方法以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较.结果恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ-PCR检出的阳性率分别为33.1%、38.5%和40.9%;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0.961.结论FQ-PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值.
关键词： 疟原虫 恶性 荧光定量聚合酶链式反应 检测 -
淡色库蚊抗性种群和敏感品系中铁蛋白基因表达量的分析
目的 对淡色库蚊抗性种群和敏感品系中的铁蛋白基因表达量进行分析.方法 设计引物,扩增目的基因全长、纯化测序、序列分析,荧光定量PCR检测铁蛋白基因的表达水平;采用假设检验中的t检验方法,对2种不同处理的淡色库蚊样本体内铁蛋白基因表达量进行统计分析.结果 成功扩增淡色库蚊铁蛋白基因片段,经荧光定量PCR测定,淡色库蚊敏感品系铁蛋白荧光定量(F敏)和抗性种群铁蛋白荧光定量(F抗)平均值分别为11.41和15.73,内参基因荧光定量(β敏和β抗)平均值分别为10.03和18.27,铁蛋白基因在淡色库蚊抗性种群中的表达量是敏感品系的15.08倍,t检验结果显示,两样本体内铁蛋白基因表达差异有统计学意义(t=26.100,P<0.001).结论 淡色库蚊铁蛋白基因可作为蚊虫抗性检测及治理的靶标基因.
关键词： 淡色库蚊 铁蛋白 荧光定量聚合酶链式反应 -
AFP、h-TERT及VEGF基因在肝细胞癌患者外周血中的诊断价值
目的:探讨肝细胞癌(HCC)患者外周血中甲胎蛋白(AFP)、端粒酶逆转录酶(h-TERT)及血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达及联合检测对诊断HCC的应用价值.方法:应用荧光定量PCR(FQ-PCR)对40例HCC、20例肝外良性疾病及10例正常体检人群的外周血AFP mRNA、h-TERT mRNA及VEGF mRNA的表达量进行检测,结果:3种指标在HCC患者中阳性率分别为77.5％、85％及72.5％,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)且AFP mRNA、VEGFmRNA的阳性表达与HCC患者血清AFP水平无关(P＞0.05),h-TERT mRNA与患者血清AFP水平存有相关性(P=0.01)；3种指标与HCC患者的TNM分期高度相关(P＜0.01).AFPmRNA在诊断HCC特异性较高,而AFP mRNA和h-TERT mRNA联合检测效果更好(敏感度92.％,特异度80％).结论:3种指标对诊断HCC均能起到良好的参考作用,联合检测AFP mRNA及h-TERT mRNA能增加诊断HCC的敏感度及特异度.
关键词： 肝细胞肝癌 荧光定量聚合酶链式反应 甲胎蛋白 端粒酶逆转录酶 血管内皮生长因子 -
乙肝病毒基因型与肝脏病理改变的关系
目的:探讨乙型肝炎病毒基因型与慢性乙型肝炎患者肝脏病理变化的关系.方法:应用乙肝病毒型特异性引物采用巢式聚合酶链反应(PCR)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),对北京佑安医院住院92例慢性乙型肝炎患者进行乙型肝炎病毒基因型及亚型分析,参照2000年《病毒性肝炎防治方案》对慢性肝炎进行病理分级、分期诊断.结果:92例慢性乙型肝炎患者中HBV基因型分布为B型17例(B2亚型),B/C混合型17例(B2/Ca亚型),C型58例(Ca亚型).17例HBV B型感染患者中病理诊断肝脏炎症活动分级为G1-G3期分别为35.29%,58.82%,5.88%;肝脏纤维化程度分级为S1-3级分别为58.82%,29.41%,11.76%.17例HBV B/C型感染患者中病理诊断肝脏炎症活动分级为G1-G3期35.29%,52.94%,11.76%;肝脏纤维化程度分级为S1-3级23.52%,52.94%.23.52%.58例HBV C型感染患者中病理诊断肝脏炎症欢旨段狦1-G4期31.03%,24.14%,36.21%,8.62%;肝脏纤维化程度分级为S1-4级25.86%.39.66%,5.17%,29-31%;HBV三组不同基因型的慢性乙型肝炎患者肝组织病理检查有统计学意义(X2=15.13,P＜0.01).HBV B型与B/C型感染患者年龄在21-30岁组58%-76%,31-40岁组17.6%-29.4%,C型感染患者年龄在21-30岁组25%,31-40岁组46.6%,40岁以上有24.24%:不同HBV基因型感染患者的年龄分布有显著性差异(X2=9.54,P＜0.05).结论:慢性乙型肝炎患者HBV基因型中C型比例明显高于B型与B/C型.HBV C型患者肝脏病理变化较B型与B/C型严重.不同HBV基因型感染患者的年龄分布不同.
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痘苗病毒辅助的重组丙型肝炎病毒生产体系中生产细胞的选择
目的:探讨痘苗病毒辅助的重组丙型肝炎病毒制备体系中生产细胞的选择.方法:将已构建好的质粒pT7HCV及pVHCV分别共转染BHK21,HepG2,SMMC7721细胞株,4 h后用痘苗病毒感染细胞,96 h后用RT-PCR检测HCV的RNA表达.用荧光定量PCR方法检测培养上清中RNA的拷贝数,并用Western blot检测结构蛋白E2以及非结构蛋白NS5的表达.结果:PT-PCR检测到各细胞株培养上清中均有HCV的RNA的存在,定量PCR显示RNA的拷贝数在BHK21,HepG2,SMMC7721细胞中的产量分别为(2.974±0.8)×107,(1.99±0.17)×105,(1.19±0.17)×105(copies/mL).Western blot检测到在这3种生产细胞中均有HCV非结构蛋白NS5的表达.结论:BHK21,HepG2,SMMC7721细胞株均可生产出重组丙型肝炎病毒颗粒,且以BHK21为生产细胞株时产量高.
关键词： 重组丙型肝炎病毒 痘苗病毒 荧光定量聚合酶链式反应 -
胎盘滋养层细胞的感染和凋亡与HBV的宫内传播机制
目的:通过HBV感染体外培养的人绒毛膜滋养层细胞,探讨HBV宫内感染发生的机制.方法:对人早孕绒毛膜滋养层细胞进行原代培养和对人滋养层细胞系JEG-3进行传代培养,将HBV感染血清与原代及传代培养细胞共同孵育8-48 h,倒置显微镜观察细胞形态及细胞间连接,细胞免疫荧光和免疫组织化学染色方法检测滋养层细胞中HBsAg和HBcAg的表达,荧光定量PCR方法检测被感染的滋养层细胞中的HBV DNA,TUNEL方法检测滋养层细胞的凋亡.结果:与HBV阳性血清共同孵育对滋养层细胞的形态和细胞间连接无明显影响;细胞免疫荧光和免疫组织化学染色结果显示,滋养层细胞与HBV感染血清共同孵育(8,24,48 h)后,滋养层细胞可以出现HBsAg和HBcAg的阳性表达,24 h时HB sAg阳性细胞数量多(8 h:18.0%±3.67%;24 h:30.6%±2.88%;48h:24.8%±4.21%);荧光定量PCR方法检测到被感染的滋养层细胞中HBV DNA的存在;TUNEL结果显示,与HBV感染血清共同孵育可导致滋养层凋亡细胞数量逐渐增加(24 h:18.6%±3.05%;48 h:26.8%±2.86%;P＜0.01).结论:滋养层细胞的感染可能是HBV通过胎盘屏障的途径之一;HBV感染可以诱导滋养层细胞产生凋亡,这可能是胎盘屏障阻止HBV宫内感染的一种保护性机制.
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鼻咽癌高癌家系成员基因组稳定与修复基因表达的研究
目的:探讨鼻咽癌高癌家系成员基因组稳定与修复基因的表达情况.方法:在鼻咽癌高发区广东省中山市,选择鼻咽癌高癌家系成员为研究对象,以鼻咽炎及鼻咽癌患者为对照,抽提鼻咽组织RNA,合成cRNA,以基因组稳定和修复功能分类基因芯片杂交及化学发光法检查其基因的表达情况,并实时荧光定量PCR技术进行验证.结果:鼻咽癌高癌家系成员DNA损伤修复基因主要以上调表达为主,且上调幅度高,上调100倍以上的基因包括TEP1、MSH4和PMS2L1;下调的基因少且幅度低,泛素类基因多表现为下调,实时荧光定量PCR检验结果基本一致.结论:鼻咽癌高癌家系成员存在着特定的DNA损伤修复基因变化规律.
关键词： 鼻咽肿瘤 高癌家系 基因组稳定与修复基因 基因芯片 荧光定量聚合酶链式反应 泛素 -
荧光定量聚合酶链式反应检测生殖道沙眼衣原体的临床应用
目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测技术在泌尿生殖道沙眼衣原体的应用.方法 用FQ-PCR法和抗原检测法对怀疑有沙眼衣原体感染的65例门诊患者分别进行检测.结果 两种方法阴性符合率为97.73%,阳性符合率为76.19%(P<0.05),差异有统计学意义.结论 FQ-PcR法作为一种核酸定量技术、具有高特异、高敏感的特点,不仅可以准确诊断,而且其定量技术可指导临床用药,值得推广.
关键词： 荧光定量聚合酶链式反应 沙眼衣原体 泌尿生殖道感染 -
复方浙贝颗粒联合阿霉素对P388移植瘤p53基因表达影响
目的 探讨复方浙贝颗粒联合阿霉素对P388移植瘤的p53基因表达影响. 方法 将小鼠淋巴细胞白血病细胞系P388细胞接种于昆明小鼠腋前皮下构建小鼠移植瘤模型,予复方浙贝颗粒(灌胃)联合不同剂量的阿霉素(腹腔注射)治疗.治疗14天后处死小鼠,剥离肿瘤,荧光定量聚合酶链式反应法检测各组移植瘤组织p53基因表达,2-△△Ct法计算各组p53基因的相对定量. 结果 各组移植瘤中p53基因相对表达的2-△△Ct值比较,差异无统计学意义(F=0.56,P=0.7557).其中,CZBG中剂量联合ADM大剂量组p53基因相对表达量较高,而CZBG中剂量联合ADM小剂量组p53基因相对表达量较低. 结论 CZBG与ADM联合使用能够上调P388移植瘤中p53抑癌基因的表达.
关键词： 复方浙贝颗粒 荧光定量聚合酶链式反应 P388细胞 移植瘤 P53 -
CMV-DNA检测在新生儿黄疸并CMV感染中的诊断价值
目的 探讨巨细胞病毒(CMV)DNA检测在新生儿黄疸中的诊断价值.方法 采用荧光定量聚合酶链式反应检测血液和尿液中的CMV-DNA浓度,采用化学发光方法定量检测血清中的CMV-IgM抗体.比较不同方法与不同标本的差异性.结果 CMV-DNA阳性:尿液标本中14例(9.3％),血液标本阳性12例(8.0％);CMV-IgM抗体阳性2例(1.3％).血液和尿液的CMV-DNA诊断一致性分析Kappa值为0.75,在0.61～0.8间,高度一致.结论 CMV-DNA诊断新生儿黄疸合并活动性巨细胞病毒感染比CMV-IgM抗体更有价值,尿液和血液CMV-DNA的检出结果一致,可以利用尿液代替血液进行巨细胞病毒的检测.
关键词： 巨细胞病毒 新生儿黄疸 化学发光 荧光定量聚合酶链式反应 -
乙肝患者血清学标志物和HBV DNA定量分析
乙型肝炎是一种世界性的传染性疾病,我国现症感染者众多,临床常见的HBV感染检测指标有血清乙型肝炎病毒两对半抗原抗体系统(HBsAg和抗HBc、抗HBc、HBeAg 和抗HBe)、抗HBc-IgM和HBV DNA的PGR检测.这三种检测方法各有其侧重点,本研究应用ELISA 和FQ-PCR检测了乙型肝炎患者血清抗HBc-lgM、HBV血清两对半抗原抗体系统和HBV DNA,旨在分析乙型肝炎病毒各种标志物间的相互关系及在综合分析乙肝病情中的作用.
关键词： 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 荧光定量聚合酶链式反应 抗原 抗体 -
尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒检测的临床意义
目的:对于尖锐湿疣(CA)患者进行人乳头瘤病毒(HPV)分型,以及DNA定量检测.方法:以荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)对146例患者的疣体处进行DNA检测与HPV分型.(标本从我院取材,由广州市金域医学检验中心得出测验与分型结果.)结果:146例尖锐湿疣患者经过治疗,102例痊愈,44例复发.HPV分型表明,阳性DNA为140例;126例基因型表现为6/11;15例基因型表现为16/18;8例基因型表现为6/11与16/18的合并.结论:HPV测定可以有效预测尖锐湿疣人乳头瘤病毒患者CA复发与癌变的可能性.
关键词： 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒 荧光定量聚合酶链式反应 -
聚合酶链式反应与细胞培养在女性生殖道沙眼衣原体感染诊断中的比较分析
目的:比较荧光定量聚合酶链式反应( FQ-PCR)与细胞培养对女性生殖道沙眼衣原体感染的检测效果.方法:对门诊300例无生殖道感染症状女性患者的宫颈分泌物分别采用FQ-PCR与细胞培养法进行沙眼衣原体的检测.结果:两种方法均为阳性32例,占10.67％.两种方法均为阴性252例,占84.00％.FQ-PCR阳性而细胞培养阴性13例,占4.33％.细胞培养阳性而FQ-PCR阴性3例,占1.00％.细胞培养的敏感性为72.92％,FQ-PCR的敏感性为93.75％；两种方法的阳性符合率为66.67％,阴性符合率为94.03％.两种检测方法的结果差异有统计学意义(P＜0.05).结论:FQ-PCR和细胞培养两种方法各有优劣,均可适用于沙眼衣原体感染的诊断,临床工作者可根据自己的实际情况进行选择.
关键词： 沙眼衣原体 荧光定量聚合酶链式反应 细胞培养 -
乳汁HBV标志物检测对乙肝产妇哺乳的指导价值
我国是乙型肝炎流行高发区,HBSAg阳性人口约占人口10%-15%.世界卫生组织提倡母乳喂养,但母婴传播是乙肝病毒(HBV)主要的传染途径之一,对乙型肝炎病毒携带者能否母乳喂养国内尚有争议.本研究应用荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验试验(ELISA)技术对我院血清HBSAg阳性产妇进行血清和乳汁HBV-DNA及HBV免疫血清学标志物(HBV-M)检测,并对结果及其相关性和对乙肝产妇哺乳的指导价值进行分析.
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原发性肝癌患者外周血中AFPmRNA检测的临床意义
通过定量检测AFPmRNA在原发性肝癌(PHC)患者外周血中的表达,探讨AFPmRNA作为PHC患者早期诊断和微转移指标的可能性.建立荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR),检测58例外周血AFPmRNA的表达量.其中,30例PHC患者中19例AFP≥20ng/ml,23例外周血中AFPmRNA有表达;肝癌患者外周血中AFPmRNA的基因拷贝数与肝癌患者有肝内外转移有明显相关,而肝炎及健康对照组外周血中AFPmRNA均未表达,肝硬化组有一例表达.应用荧光定量PCR检测PHC外周血中AFPmRNA表达情况,可以作为早期反映PHC患者外周血中是否存在肝癌细胞和发生微转移的早期灵敏指标.
关键词： 原发性肝癌 荧光定量聚合酶链式反应 甲胎蛋白mRNA 外周血 -
FAK对增生性瘢痕成纤维细胞中信号转导因子表达的影响
目的 了解FAK SiRNA对于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞中与瘢痕增生相关因子整合素α1、TGF-βR、黏着斑激酶(Focal adhesive kinase,FAK)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响,探索治疗增生性瘢痕的基因治疗方法. 方法 设计特异性探针合成FAK SiRNA片段,脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,并用荧光定量PCR法(FO-PCR)检测、比较转染前后成纤维细胞内以上各因子的mRNA表达量的变化. 结果 转染48 h后,FAK mRNA、整合素α1 mRNA、TGF-βR mRNA、α-SMA mRNA的表达明显下降(P＜0.05). 结论 FAK SiRNA可能通过抑制增生性瘢痕成纤维细胞中整合素α1、TGF-βR、FAK和α-SMA的表达,从而抑制瘢痕的增生与挛缩.
关键词： 增生性瘢痕 黏着斑激酶 小片段干扰核糖核酸 荧光定量聚合酶链式反应 -
两种材料修复体的冠边缘粘性放线菌的检测
目的 研究老年患者中,两种材料修复体冠修复前后不同时期冠边缘龈下菌斑中粘性放线菌的定植变化.方法 收集门诊就诊老年患者中下颌第一磨牙要求行冠修复的患者共60例,随机编入二氧化锆组与钯银合金烤瓷冠组,采用自身前后对照法,将牙体预备前的患牙设为对照组,冠修复后6个月、12个月的患牙设为试验组,并分别在这3个时期收集冠边缘龈下菌斑,采用荧光定量聚合酶链式反应技术对临床样本进行粘性放线菌的相对定量分析.结果 与修复前比较,二氧化锆全瓷冠组修复后6个月、12个月的粘性放线菌相对定量值差异无统计学意义(P>0.05);钯银合金烤瓷冠组修复后6个月、12个月的粘性放线菌相对定量值差异有统计学意义(P<0.05).结论 二氧化锆全瓷冠可能可以更好地降低冠修复后患继发龋的风险.
关键词： 老年人 粘性放线菌 荧光定量聚合酶链式反应 -
随机扩增多态性技术联合荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法的建立
目的 结合随机扩增多态性技术(RAPD)和荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR)的优势,建立快速、准确地检测结核分枝杆菌的新方法.方法 根据国内外文献设计随机引物,以结核分枝杆菌标准菌株 H37Rv 为模板进行 RAPD,产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取条带进行割胶纯化测序,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序上进行同源性检索,结果和结核分枝杆菌匹配率都达到99％.设计特异性内引物和探针,以RAPD产物为模板进行qPCR,并优化反应条件.分别以10倍梯度稀释的一系列浓度的H37Rv和其他阴性对照菌为模板,进行qPCR和RAPD-qPCR,分析其灵敏性和特异性.结果 qPCR能够检测到30 pg/μl的结核分枝杆菌,而RAPD-qPCR灵敏性提高到3 fg/μl.而且RAPD-qPCR检测30 pg/μl至30 fg/μl的结核分枝杆菌核酸时,扩增得到的Ct值都较小[(6.58±0.19))～(14.95±0.36)],结果稳定,易于判断.qPCR和RAPD-qPCR检测其他临床常见的细菌均呈现阴性.结论 RAPD-qPCR是一种快速、准确地检测出结核分枝杆菌的新方法.
关键词： 结核分枝杆菌 随机扩增多态性技术 荧光定量聚合酶链式反应 -
乙肝系列血清学标志和HBV DNA定量分析
目的:探讨乙型肝炎病毒血清学指标的表现模式与HBV DNA之间的内在联系.方法:949例在本院就诊有诊断不同的病人血清标本,用ELISA法检测949例病人血清标本的各血清免疫学标志,用荧光定量PCR法实时定量检测HBV DNA.结果:HBeAg阳性的标本HBV DNA全部呈阳性,阳性率达100%,并且HBVDNA载量平均值大于107拷贝/ml.HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性的模式中HBV DNA阳性率高达84.1%,平均拷贝数在106～107/ml之间.有61例检测不到e系统,但有59例HBVDNA呈阳性,平均拷贝数也较高.HB-sAg阴性而其他抗体阳性的HBV DNA阳性率达9.7%,平均拷贝数较低,在104/ml左右.ELISA法全阴的HBV DNA阳性率为4.2%,平均拷贝数为104/ml.抗-HBc-IgM阳性者,HBV DNA阳性率为98.7%.前S1蛋白阳性者,HBV DNA阳性率为93.8%.结论:尽管HBeAg、抗-HBc-IgM、前S1蛋白(PreS1)等血清学标志是乙肝病毒复制的良好指标,但不能代替HBV DNA的定量测定,只有HBV DNA才是乙型病毒性肝炎复制和传染性的直接病原学依据.这种实时定量检测的荧光定量PCR技术可以检测HBV的真实感染和复制情况,它和ELISA法检测的血清学指标相结合,具有临床价值.
关键词： 乙型肝炎病毒核酸 荧光定量聚合酶链式反应 基因变异 抗原 抗体
