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人Calnexin基因慢病毒载体及稳定表达 Calnexin蛋白的宫颈癌细胞株构建
目的 构建人Calnexin基因慢病毒载体及稳定表达Calnexin蛋白的人宫颈癌Hela细胞株,为进一步探讨Calnexin基因对宫颈癌潜在的调控作用提供细胞模型.方法 采用TRIzol提取宫颈癌细胞Hela细胞株总RNA,RT-PCR法逆转录出含有目的基因Calnexin的cDNA序列;根据Calnexin的cDNA序列,选择EcoR1、BamH1限制性酶切位点作为目的位点,设计FLAG-Calnexin基因的PCR引物;利用PCR法从Hela细胞cDNA中扩增出FLAG-Calnexin基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-puro中,得到重组慢病毒pLVX-FLAG-Calnexin质粒.将慢病毒包装质粒与pLVX-FLAG-Calnexin重组质粒共转染到人肾上皮293T细胞中,获得携带FLAG-Calnexin基因序列的重组慢病毒.将慢病毒感染Hela细胞24 h,在细胞培养基中加入1.0μg/mL嘌呤霉素,药筛48 h.后筛选出稳定表达FLAG-Calnexin蛋白的Hela细胞,采用Western blotting法、Real-time PCR法检测该细胞内的Calnexin蛋白及mRNA.结果 构建完成的重组质粒经菌落PCR、重组质粒的双酶切、质粒PCR验证后,条带位置对应片段大小与目的基因大小一致,且经质粒测序后与Calnexin基因片段比对一致.经过慢病毒感染、药物筛选后得到的Hela细胞中的Calnexin蛋白及mRNA的相对表达量分别为2.14±0.25、6.15±0.21,高于野生型Hela细胞及转入空载的对照细胞(P均<0.01).结论 成功构建了人Calnexin基因慢病毒载体,同时建立、筛选出了能够稳定表达Calnexin蛋白的Hela细胞株,为进一步探讨Calnexin在宫颈癌发生发展中的作用提供了细胞模型.
关键词： Calnexin基因 慢病毒载体 宫颈癌细胞 Hela细胞
