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可溶性EGF受体胞外域在HeLa细胞中的表达及鉴定
目的:在哺乳动物细胞中表达可溶性人表皮生长因子受体(sEGFR)并进行鉴定.方法:以带信号肽的sEGFR的真核表达载体pEGFRs或pEGFP-N1空载体转染HeLa细胞,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析外源基因的表达水平,并以免疫印迹法分析培养上清中的sEG-FR.结果:转染pEGFP-N1的HeLa细胞,48 h后EGFP的表达百分率可达83%,而转染pEGFRs载体的HeLa细胞EGFP阳性率为4.8%,表明由于插入的sEGFR基因包含终止密码而抑制了EG-FP的表达;共聚焦显微镜观察也得到一致的结果.进一步以抗EGFR结构域L2的抗血清进行免疫印迹分析证明,转染pEGFRs的HeLa细胞培养上清液中表达sEGFR,存在相对分子质量为83 000和80 000两种产物.结论:转染表达载体的HeLa细胞分泌表达sEGFR.
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人EGF受体胞外域cDNA克隆及其序列分析
目的:克隆编码人表皮生长因子受体(EGFR)胞外域的cDNA,构建可溶性EGFR(sEGFR)的哺乳动物细胞表达载体.方法:以RT-PCR方法从人胎盘中克隆编码EGFR胞外域的cDNA,测定其序列,构建sEGFR真核表达载体.结果:从人胎盘绒毛组织中成功克隆编码EGFR胞外域的cNDA,通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并添加终止密码,构建了sEGFR的真核表达载体.该基因编码的蛋白质包含信号肽以及L1、S1、L2和S2等4个结构域.序列分析表明该基因有3个碱基与以往报道的基因不同,即1562G→A、1620G→C、1887T→A,前两个改变导致氨基酸Arg497Lys和Lys516Asn的改变,后一个为同义突变Thr605.结论:成功克隆编码EGFR胞外域的cDNA,并构建了sEGFR真核表达载体.
