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治愈的肺结核患者治疗前后血清蛋白双向电泳初步比较分析
选取2013年于广州市胸科医院治疗的初治肺结核,并经1个常规抗结核治疗疗程(6个月)治愈的42例患者作为研究对象,采用双向凝胶电泳技术(two dimension electrophoresis,2-DE)对研究对象治疗前、后的混合血清全组蛋白进行电泳分离,以PDQuest 8.0软件根据蛋白质点数、等电点(isoelectric point,PI)、相对分子质量(relative molecular mass,Mr)等进行差异蛋白描述性分析.结果显示,研究对象治疗前、后差异蛋白点共有15个,治疗后血清相对应差异蛋白有12个下调,3个上调,Mr为16 200～76 800,PI为5.0～6.8.由此可见,治愈的肺结核患者治疗前后血清中存在特异性的差异蛋白,差异蛋白可能作为结核病的重要诊断标志物或者治疗靶点.
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应用2D-DIGE及MALDI-TOF-MS筛选胰腺癌血清标志物
目的 利用比较蛋白质组学的方法对胰腺癌患者血清和对照组血清例进行分析,寻找胰腺癌潜在的特异性候选标志物.方法 采用双向差异凝胶电泳分离40例胰腺癌患者、10例慢性胰腺炎患者、10例良性肿瘤患者和40例健康体检者外周血清蛋白质,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对差异显著的蛋白进行鉴定.结果 成功鉴定出2个胰腺癌差异表达蛋白:转甲状腺素蛋白和载脂蛋白E.该组蛋白在胰腺癌组中呈高表达,在正常对照组、慢性胰腺炎组和良性肿瘤组中呈低表达.结论 双向差异凝胶电泳联合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术筛选胰腺癌患者外周血清中的特异性生物标志物的方法具有较好的重复性和稳定性.检测鉴定的差异蛋白质载脂蛋白E、转甲状腺素蛋白可能是胰腺癌早期诊断潜在的血清特异性生物标志物.
关键词： 胰腺癌 蛋白质组学 双向差异凝胶电泳 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 标志物 -
不稳定型心绞痛患者血浆蛋白标记物的蛋白质组学筛选
目的 分析冠心病不稳定型心绞痛(UAP)与稳定型心绞痛(SAP)患者血浆中的差异蛋白质,筛选可能与UAP早期诊断密切相关的血浆蛋白标记物.方法 分别收集2014年6月-2015年4月南方医科大学第三附属医院UAP及SAP血浆标本各60例,另收集体检科收集的血浆标本作为正常对照组(n=60).随机取对照组(n=10)、UAP组(n=10)与SAP组(n=10)空腹血浆标本各100μl,分别等量混合成3组样本,去除血浆高丰度蛋白后,利用双向差异凝胶电泳(DIGE)技术进行蛋白分离,经差异软件分析后,采集UAP和SAP之间变化2倍以上的差异蛋白质点,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间/飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对差异蛋白点进行鉴定.每组随机选取40份血浆样本,选取UAP特异性差异蛋白进行ELISA验证.结果 UAP与SAP组患者血浆相比较,共筛选出10个表达量差异2倍以上的差异蛋白点,包括9个上调蛋白点,1个下调蛋白点.经质谱鉴定后,表达上调的蛋白包括纤维蛋白原γ链(FGG)、补体C4-B(C4B)、免疫球蛋白κ链C结构域(IGKC)和血红蛋白α亚基(HBA1);表达下调的蛋白是结合珠蛋白(HP).与对照组比较后,在这些差异蛋白中共找到2个UAP特异性相关蛋白,即IGKC和HP.选取IGKC进行ELISA验证,结果表明,与对照组和SAP组相比较,UAP组样本中IGKC特异性表达上调(P<0.05),与DIGE验证结果一致.结论 筛选到UAP特异性相关蛋白IGKC和HP,IGKC有可能成为UAP早期筛查及诊断的特异性生物标记物.
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基因工程药物中宿主细胞蛋白的检测与控制
宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCPs)是基因工程菌株或细胞株自身产生的与基因工程目的产物无关的蛋白混合物,其中有些蛋白是工程菌株或细胞株生存、繁殖及其他正常生理活动所必须的,其在产品生产过程与目的产物共同纯化且不能被去除.HCP的组成与丰度在生产的各个阶段与终产品都各自不同,其决定于许多不同因素.ELISA(enzyme-linked-immunosorbent assay)是HCP定量检测中常用的分析手段,但是由于依赖于特异性抗体的产生,在许多情况下也限制了该方法的检测应用.可视化检测技术(如双向差异凝胶电泳)与定性检测技术(如质谱分析)成为ELISA检测的有力验证与补充.对HCP及其产生机制越来越深入的理解有助于我们设计基因工程药物的生产过程(从上游细胞系的选择到下游纯化手段的选择),从而降低或去除终产品中的HCP.
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髓母细胞瘤与室管膜瘤脑脊液差异凝胶电泳方法的建立
目的：建立脑脊液双向差异凝胶电泳方法，寻找髓母细胞瘤脑脊液、室管膜瘤脑脊液与正常脑脊液三者之间的差异蛋白表达。方法选取3例已确诊髓母细胞瘤患者脑脊液等体积混合为髓母细胞瘤组（M）；3例已确诊室管膜瘤患者脑脊液等体积混合为室管膜瘤组（E）；3例正常脑脊液等体积混合为正常对照组（CON）；分别采用10％TCA/冰丙酮沉淀法除盐提取蛋白；蛋白等量混合为内标组（S）；将各组蛋白分别经花青染料 Cy2、Cy3和 Cy5标记，混合后进行双向差异凝胶电泳（2D-DIGE），分别在波长488 nm、532 nm 和633 nm 激发光下扫描，所获得图像用 DeCy-der 5．0图像软件进行蛋白质表达差异分析。结果DeCyder 的胶内差异分析（DIA）模块显示胶1、胶2和胶3分别检测到1552、1547和1566个蛋白质点。DeCyder 的生物学差异分析（BVA）模块显示表达量变化超过两倍的差异蛋白质点，在髓母细胞瘤组与正常对照组中有36个；室管膜瘤组与正常对照组中有71个；而髓母细胞瘤组与室管膜瘤组中有52个。其中仅在髓母细胞瘤中上调的蛋白质点有8个，仅在室管膜组中升高的蛋白质点10个。结论脑脊液双向差异凝胶电泳方法的成功建立，为髓母细胞瘤与室管膜瘤脑脊液中标志蛋白探寻研究奠定了基础。
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Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的蛋白质组学研究
目的 识别AD细胞模型中蛋白质组改变,在蛋白质水平上揭示Aβ的作用机制.方法 利用双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)和质谱(MS)技术.探索20μmol/L浓度Aβ_(25-35)肽段作用48h后PC12细胞蛋白质组的改变.结果 2D-DIGE图像上出现约2000个蛋白点.与对照组比较,Aβ_(25-35)作用下共有29个蛋白的表达有显著差异,其中25个蛋白表达量上调及4个蛋白表达量下调超过30%.质谱鉴定出7个蛋白点,分为3类:(1)具有分子伴侣活性的蛋白:葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,GRP75)、热休克同源蛋白71(heat shock cognate 71 kDa protein,HSC71)、calreticulin表达量均上调.(2)细胞骨架蛋白:β-微管蛋白(tubulin beta chain 15,TBETA-15)和低分子量神经细丝蛋白(neurofilament light polypeptide,NF-L)表达量亦上调.(3)与能量代谢有关的酶:肌酸激酶B(creatine kinase-B,CKB)和醛缩酶A(aldolaseA)蛋白表达量均下调.结论 本实验首次将DIGE和MS方法应用于Aβ_(25-35)神经毒性作用机制研究,在蛋白质组水平上揭示了Aβ_(25-35)毒性作用的早期机制.
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慢性砷暴露人群血清差异表达蛋白研究
目的 筛选慢性砷暴露人群血清差异表达蛋白,为寻找慢性砷暴露和砷中毒的血清蛋白标志物提供线索.方法 在山西省饮水型地方性砷中毒病区村进行现场调查,收集调查对象的人口学基本特征、饮水砷暴露史、吸烟、饮酒和健康情况等信息.根据饮水水砷浓度分组:低砷组(水砷暴露＜ 10μg/L)、中砷组(水砷暴露10 ～ 50 μg/L)、高砷组(水砷暴露＞50 μg/L)、砷中毒组(过去水砷暴露＞50 μg/L,改水后目前水砷＜10μg/L),选择符合入组条件的调查对象,每组30例.砷中毒组诊断依据《地方性砷中毒诊断标准》(WS/T 211-2001)进行.根据知情同意的原则,采集4组人群静脉血,取血清,采用双向差异凝胶电泳(two-dimensional differential gel electrophoresis,2-D DIGE)筛选不同水砷浓度暴露组及砷中毒组血清差异表达蛋白,采用质谱进行蛋白鉴定.结果 在6张胶图中平均检测出蛋白点(1299±167)个,其中在5张胶中均出现的蛋白点有688个.在低、中、高砷组,有33个蛋白点存在差异表达(P＜ 0.01)；在低、中、高砷、砷中毒组,有54个蛋白点存在差异表达(P＜0.01).对其中的25个蛋白点进行了质谱鉴定,成功的鉴定出13种蛋白.与低砷组比较,载脂蛋白A-Ⅳ、血浆视黄醇结合蛋白、雌激素受体(下丘脑亚型)在中、高砷组表达下调,补体4A和4B表达上调；与低、中、高砷组比较,β2糖化蛋白Ⅰ、角蛋白1、血红素结合蛋白前体、补体C1r亚单位、纤维凝胶蛋白3在砷中毒组表达下调,色素上皮衍生因子、α1-微球蛋白、羧肽酶N端催化链表达上调.结论 慢性砷暴露对人群血清蛋白产生显著影响,砷中毒人群血清中出现的差异表达蛋白不会在短期内随着饮水砷浓度的下降而全部得到改善,鉴定的差异表达蛋白能否作为慢性砷暴露或砷中毒的血清标志物还有待于进一步验证.
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脑囊尾蚴病脑脊液差异凝胶电泳方法的建立
目的 建立脑脊液差异凝胶电泳方法,以获得高分辨率的荧光差异双向电泳图谱.方法 取确诊的4例脑囊尾蚴病患者脑脊液和4位健康人脑脊液,分别用冰丙酮沉淀法除盐提取蛋白,均等量混合后为脑囊尾蚴病组与健康人对照组,两组总蛋白等量混合为内标组.将各组蛋白分别经花青染料2(Cy2)、Cy3和Cy5标记,再进行单向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向差异凝胶电泳(2-D DIGE),分别在波长488 nm、532nm和633nm激发光下扫描,所呈图像分别用ImageQuant和DeCyder 5.0图像分析软件进行蛋白表达差异分析.用DeCyder中的胶内差异分析(DIA)模块对2-D DIGE扫描图像进行蛋白质点检测和含量分析.用DeCyder中的生物学差异分析(BVA)模块分析两组蛋白表达的生物学差异.结果 ImageQuant分析结果表明,所有脑脊液全蛋白样品均能被Cy2、Cy3和Cy5标记,荧光强度随蛋白含量的上升而增强.DLA分析显示,胶1和胶2分别检测到896和894个蛋白质点.胶2与胶1进行匹配,蛋白质点匹配率达90%.BVA分析发现,在脑囊尾蚴病组与健康人组脑脊液蛋白共有表达量变化超过两倍的差异蛋白质点55个,其中在脑囊尾蚴病组中表达上调2倍的有47个蛋白质点,下调2倍以上的有8个蛋白质点.结论 以脑囊尾蚴病患者脑脊液建立的差异凝胶电泳方法,获得的2-D DIGE图谱,图像清晰,分辨率高,为脑囊尾蚴病蛋白质组学研究奠定了基础.
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CA125阴性卵巢癌血清标志物差异蛋白质组学的研究
目的:通过二维差异凝胶电泳(2-DE DIGE)和基质辅助激光解吸离子化-飞行时间(MALDI-TOF/TOF)串联质谱差异蛋白质组学方法寻找CA125阴性卵巢上皮癌血清标志物,以提高卵巢上皮癌诊断的灵敏度和特异度.方法:收集103例卵巢上皮癌,60例正常对照,63例卵巢良性肿瘤、63例盆腔良性病变的血清.按年龄匹配,选取6例CA125阴性卵巢癌和6例正常对照组的血清等容积混合.祛除血清高丰度白蛋白和IgG后进行2-DE DIGE.实验重复3次.通过DeCyder软件分析得出有显著差异的蛋白质点,MALDI-TOF/TOF鉴定差异蛋白质.分别用Western Blot和ELISA方法验江获选的血清标志物.结果:(1)经2-DE DIGE实验得出有显著差异的蛋白质点41个,MALDI-TOF/TOF成功鉴定了其中的28个蛋白质点.上调显著的蛋白质点为结合珠蛋白(haptoglobin,Hp),下调显著的蛋白质为转铁蛋白(transferrin,Tf);(2)Western Blot和ELISA验证结果显示,CA125阴性卵巢上皮癌血清Hp和Tf与正常对照有显著差异(P<0.001);(3)CA125+Hp+Tf联合检测(两者或两者以上阳性判断为阳性)诊断卵巢上皮癌的灵敏度和特异度高于CA125、Hp和Tf单独检测.结论:Hp和Tf是卵巢上皮癌血清中差异表达的蛋白质,可作为卵巢上皮癌的血清标志物.CA125+Hp+Tf联合检测有助于提高卵巢上皮癌诊断的灵敏度和特异度,有助于提高CA125阴性卵巢上皮癌的检出率.
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2D-DIGE蛋白质组技术的探讨及其在微生物研究中的应用
目的:探讨双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D - DIGE)的实验方法,分析比较其优缺点,概述其在微生物研究中的应用.方法:以两株不同血清型的副溶血性弧菌为样本,通过2D - DIGE实验,得到两组蛋白质荧光染色分布图,与银染的效果比较.结果:直观的看到两株细菌的蛋白质差异,且可分析样品丰度变化.结论:该方法有一定的局限性,但却是研究蛋白质组丰度变化的强有力工具.
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胰腺癌血清相关蛋白质分子的差异表达
目的 利用双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)的方法建立胰腺癌、慢性胰腺炎和正常对照人群外周血清的差异蛋白质双向凝胶电泳图谱并分析差异蛋白质点.方法 双向差异凝胶电泳分离20例胰腺癌患者、10例慢性胰腺炎患者和20例正常对照组人群外周血清蛋白,比较不同血清中蛋白质表达的差异.结果 成功建立胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人之间的外周血清蛋白质双向差异凝胶电泳图谱,软件分析共发现了168个明显差异表达的蛋白质点,其中在胰腺癌组与正常对照组的比较中有22个蛋白质点在胰腺癌血清中表达上调,29个蛋白质点下调;在胰腺癌组和慢性胰腺炎组的比较中有24个蛋白质点在胰腺癌血清中表达上调,54个表达下调;在慢性胰腺炎组和正常对照组的比较中有20个蛋白质点表达上调,19个蛋白质点表达下调.结论 双向差异凝胶电泳是快速有效的分离蛋白质新的方法,得到的双向差异凝胶电泳图谱以及显著表达差异的蛋白质点为质谱鉴定提供了实验基础.
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结核肺组织与正常肺组织蛋白质组双向电泳图谱的差异分析
目的 对结核肺组织与正常肺组织双向电泳图谱进行比较分析,筛选差异表达蛋白质.方法 利用双向电泳分离结核组及正常组总蛋白质,并通过计算机图像分析软件分析电泳图谱.结果 在结核肺组织中检测有效蛋白点数为(190±11)个,正常肺组织中检测有效蛋白点数为(179±5)个.发现两者间共有15个差异蛋白点,蛋白点分子量(Mr)主要分布于15kD～80kD,PI为3～10.4个点在病灶组织中表达上调,11个点在病灶组织中表达下调.结论 通过双向凝胶电泳和图像分析技术对结核肺组织及正常肺组织蛋白质组进行研究,获得了结核组与正常组的差异蛋白点,为进一步利用质谱分析技术做差异蛋白质鉴定奠定了基础,并为肺结核的早期诊断、发病机制探索、病情监测提供依据.
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afamin在未破裂颅内动脉瘤患者血清中的表达及意义
目的 寻找未破裂颅内动脉瘤患者较正常成人血清中表达差异的蛋白.方法 选择中山大学附属中山医院(中山市人民医院)神经外科自2007年7月至2009年9月收治的未破裂颅内动脉瘤患者8例,同期体检健康者8例作为正常对照组,应用双向差异凝胶电泳(2-D DIGE)、基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析并鉴定2组血清中差异蛋白质的表达.结果 与对照组比较,未破裂颅内动脉瘤患者血清中有29个表达差异在1.5倍以上的蛋白点,其中579蛋白点在未破裂颅内动脉瘤患者血清中比对照组表达降低1.81倍,差异有统计学意义(P=0.008),经MALDI-TOF-MS鉴定为afamin.结论 afamin在未破裂颅内动脉瘤患者血清中的表达较低,可能参与了颅内动脉瘤的形成及扩张.
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血清蛋白质组学技术筛选豚鼠银屑病样模型血清蛋白质的实验研究
目的 应用血清蛋白质组学技术筛选豚鼠银屑病样模型血清中的差异蛋白质,期望从中发现与银屑病相关的血清蛋白标志物.方法 采用双向-差异凝胶电泳(2D-DIGE)和二级质谱分析鉴定豚鼠银屑病样模型血清中的差异蛋白质.结果 获得重复性和分辨率较好的血清双向差异凝胶电泳图谱,通过二级质谱分析鉴定得到3个差异的蛋白质.结论 豚鼠银屑病样模型血清与正常豚鼠血清比较存在差异表达蛋白质.
