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绵羊李斯特菌在小鼠体内的感染增殖规律及诱导的细胞因子分泌
目的 研究绵羊李斯特菌(Li)静脉接种和滴鼻接种C57BL/6J小鼠后,细菌在小鼠体内感染增殖规律及诱导的细胞免疫应答水平,为Li作为一种新型疫苗载体提供科学依据.方法 采用寇氏法测定Li静脉接种和滴鼻接种C57BL/6J小鼠的半数致死剂量(LD50);以0.1×LD50剂量静脉或滴鼻接种小鼠,测定不同时间点小鼠肝、脾和肺中的细菌载量、组织病理学改变,以及肝和脾组织匀浆液中IFN-γ、肺组织匀浆液中IFN-γ 、TNF-α和IL-6的含量.结果 Li静脉接种和滴鼻接种小鼠的半数致死剂量分别为6.3×106(cfu)和2.5×108 (cfu).Li静脉感染小鼠后能够在肝、脾和肺中增殖,引起组织细胞坏死和炎性浸润并诱导IFN-γ分泌水平上调,三种器官中肝的各指标变化显著.Li滴鼻感染小鼠后主要在肺部增殖,引起肺部病理损害并诱导肺组织IFN-γ、TNF-α和IL-6分泌水平上调.结论 静脉接种Li可以在小鼠体内引起全身性多器官的病理和免疫反应,而滴鼻接种Li可以针对性地在小鼠肺部引起病理和免疫反应;Li可以作为一种新型疫苗载体.
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致病性李斯特菌毒力因子蛋白组学及基因组学研究进展
单增李斯特菌与绵羊李斯特菌是李斯特菌属中具有致病性的两个菌种,均能在胞内繁殖,可以作为疫苗载体构建疫苗.但它们在宿主范围和致病力等方面又存在较大差异,导致两者在疫苗学和免疫学领域的应用不尽相同.从分子层面上看,两种菌独特的病原学特点与各自的主要毒力因子蛋白及相关毒力基因的差异有关.分析比较两者的毒力因子蛋白及基因,对两菌进一步在疫苗学上的应用很有必要.本文特对单增李斯特菌与绵羊李斯特菌毒力因子蛋白组学和基因组学研究进展作一综述.
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ILO与LLO协助李斯特菌黏附、侵袭细胞及胞内增殖的比较研究
目的 研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱.方法 构建含有LIi-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因或hly基因的打靶质粒,利用基因重组技术构建LI溶血素(ILO)缺陷的LI重组菌株LI△i-hly∷lacZ和回补表达LM溶血素(LLO)的重组菌株LI△i-hly∷hly;比较2株重组菌与野生LI对人肝癌HepG2细胞的黏附、侵袭能力;比较3株菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖能力.结果 重组菌株LI△i-hly∷lacZ和LI△i-hly∷hly的基因序列与预期相符;LI△i-hly∷hly、LI和LI△i-hly∷lacZ对HepG2细胞的黏附率分别为(3.43±0.82)％、(3.43±1.59)％和(3.41±1.12)％,侵袭率分别为(1.74±0.46)％、(1.22±0.75)％和(1.39±0.46)％,差异均无统计学意义;胞内增殖实验结果表明,与野生株相比,ILO缺陷株LI△i-hly∷lacZ在巨噬细胞内的增殖量降低,LI△i-hly∷hly的增殖量升高.结论 LI在细胞内的增殖水平与ILO有关,ILO缺失抑制了LI在细胞内的增殖能力,LM溶血素LLO协助细菌逃离吞噬泡进入宿主细胞质的能力强于LI溶血素ILO.
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绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价
目的 对以绵羊李斯特菌(Listeriaivano1vii,LI)为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性.方法 构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LI△inlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)差异.结果 敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LI△inlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果.减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66％和7.46％,侵袭率分别为0.031％和0.042％,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD50值分别为3.2×108 CFU/只和6.7×107 CFU/只,减毒株LD50相较于原始株明显提高.结论 成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LI△inlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低.
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表达绿色荧光蛋白的重组绵羊李斯特菌的构建及荧光分析
目的 构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组绵羊李斯特菌,为绵羊李斯特菌的研究提供重要工具.方法 利用SOEing PCR的方法将单核细胞增生性李斯特菌溶血素的启动子(phly)与GFP基因融合,连接到pCW质粒上,构建重组原核表达质粒pCW-phly-GFP.将重组质粒电转化绵羊李斯特菌,利用荧光显微镜分析荧光表达情况.分别在含红霉素和不含红霉素的BHI肉汤中连续传代培养携带重组质粒的绵羊李斯特菌,通过提取质粒和观察荧光的方法研究重组质粒pCW-phly-GFP及GFP在绵羊李斯特菌中的稳定性.结果 重组质粒pCW-phly-GFP酶切验证和测序均正确.在荧光显微镜下可以见到携带重组质粒的绵羊李斯特菌发绿色荧光.在红霉素抗性压力选择下重组质粒pCW-phly-GFP能稳定存在于绵羊李斯特菌中,并高效表达GFP.结论 成功构建了GFP基因原核表达质粒pCW-phly-GFP,能在绵羊李斯特菌中高效表达GFP,为进一步研究绵羊李斯特菌作为疫苗载体提供了重要的工具.
