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二步PCR文献资料
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人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究
目的构建人抗菌肽FALL-39定点突变子及研究其抗菌活性.方法采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),设计两对引物,引入一个突变点,通过重叠延伸法两次PCR扩增,使FALL-39第32位密码子由AAT突变为AAG,将扩增片段克隆入PGEXλ1T质粒中, 转化大肠杆菌JM109,并用IPTG诱导,表达的FALL-39-lys32经纯化后与FALL-39进行抗菌活性比较.结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变,突变后的FALL-39-lys32蛋白对大肠杆菌ML-35p的抗菌活性明显增强,其低抑菌浓度 (MIC)和低杀菌浓度(MBC)分别由FALL-39蛋白的18.75和37.50 μg/ml降低为FALL-39-Lys-32的10.94和21.88 μg/ml,对绿脓杆菌ATCC27853的MIC和MBC值分别为FALL-39蛋白的31.25和37.50 μg/ml降低为FALL-39-Lys-32的18.75和31.25 μg/ml.两种蛋白均在含Medium E的LB培养基中表现出较高活性,在LB培养基中抗菌活性低,但在同一种培养基中FALL-39-Lys-32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白.结论用两步PCR定点突变技术获得一个FALL-39-Lys32 突变子,其表达分子的抗菌活性明显增强,提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性.
