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  • 聚合酶链式反应-变性高效液相色谱法检测5种食源性致病菌

    作者:杨福江;王玉平;吴永宁;沈建忠

    目的 建立聚合酶链式反应与变性高效液相色谱(polymerase chain reaction-denaturing high-performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)相结合的方法,快速检测5种食源性致病菌(沙门菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌、大肠埃希菌O157:H7和单核细胞增生李斯特菌).方法 针对16S rRNA基因保守区设计引物,PCR 扩增产物用变性高效液相色谱仪检测,并进行敏感性、特异性、检出率等指标测定.结果 柱温61.4℃时,5种致病菌PCR产物分别呈现特异DHPLC色谱图,保留时间均为7 min左右.对沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌检出限均为5~10 CFU/ml,福氏志贺菌和大肠埃希菌O157:H7均为1~5 CFU/ml.对83株目的分离株的检出符合率为100%,38株非目的分离株检测均为阴性;对人工污染食品中的5种致病菌均可正确检出.结论 该PCRDHPLC方法具有较高的敏感性和特异性,可用于食品中5种食源性致病菌的高通量快速检测.

  • 多重PCR-变性高效液相色谱快速检测单核细胞增生李斯特菌毒力基因方法的建立

    作者:钱云开;王海洋;肖艳霞;高飞;李琳;张会敏;吴曦;张进杰

    目的 建立单增李斯特菌的多个靶基因快速检测手段,提高检测的准确性.方法 根据单增李斯特菌4个毒力基因(hly、prfA、inlA、inlB)设计引物,通过优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经变性高效液相色谱(DHPLC)进行快速检测.结果 出峰顺序依次为inlB、hly、inlA、prfA,扩增片段大小为146、210、255、388 bp,此方法具有良好的特异性,灵敏度可达到280 cfu/ml.结论 本方法可以满足实际工作中食品微生物检测的要求.

  • 改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用

    作者:

    目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响.方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达.结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响.结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系.

  • 变性高效液相色谱法检测中国汉族人SCN1A外显子16T1067A基因多态性

    作者:陈盛强;邓维意;孙卫文;麦玉珍;党利华;廖卫平;石奕武

    目的 建立检测SCN1A外显子16 T1067A单核苷酸多态性(SNP)的变性高效液相色谱(DHPLC)方法,并检测中国汉族人SCN1A外显子16 T1067A基因多态性.方法 设计针对SCN1A编码区引物,应用DHPLC技术检测其序列多态性,并检测127例中国汉族人SCN1A外显子16 T1067A基凶多态性.结果 127例汉族人中,SCNIA T1067A AA、AG、GG表型频率分别为0.8031、0.1969、0,SCNIA T1067A A、SCN1A T1067A G基因频率分别为0.9016、0.0984.结论 DHPLC简便、快速、准确.适合于大规模的人群调查.SCN1A外显子16 T1067A基因多态性在不同种族间分布存在着明显的差异.

  • 应用变性高效液相色谱技术研究肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82多态与结直肠癌发病及转移的相关性

    作者:吴剑秋;马国建;李金田;李叔平;张元颖;刘德林;张晓梅

    目的 研究肿瘤转移抑制基因KAII/CD82第8内含子IVS(8)6C11A/6T11G多态与结直肠癌发病及转移的相关性.方法 提取135例健康人、115例结直肠癌患者的外周血DNA,收集其相应的临床及病理资料,应用变性高效液相色谱技术,采用病例对照分组研究统计分析KAI1基因第8内含子剪接区域多态与结直肠癌发病及转移的相关性.结果 KAI1/CD82基因IVS(8)6T11G突变基因型检出率在正常人群为30.9%(84/135),结直肠癌患者中为31.3%(72/155),两者的差异无统计学意义(P=0.963);在结直肠癌低龄(<50岁)和高龄(≥50岁)患者之间以及性别之间差异均无统计学意义(均P>0.05);在常见的病理类型管状/管状乳头状腺癌、黏液腺癌中差异亦无统计学意义(P=0.633);在病理分级中有一定的差异性,但无统计学意义(P=0.267),而在有无淋巴结转移之间,两者差异有统计学意义(P.0.032)[6C11A有转移62.5%(80/128),无转移76.5%(78/102);6T11G有转移37.5%(48/128),无转移23.5%(24/102)].结论 肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82第8内含子剪接区域多态与结直肠癌的发病、病理类型无关,但可能影响肿瘤的淋巴结转移,提示KAI1/CD82基因IVS(8)6C11A/6T11G多态筛查可能成为结直肠癌患者预后风险评估的指标.

  • 异基因造血干细胞移植植活状态的变性高效液相色谱检测研究的首次报告

    作者:王昱;潘凯枫;陆道培

    异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义.在临床上已有多种方法用于植活检测,本研究用变性高效液相色谱(DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列(STR-PCR)检测造血干细胞移植植活状态的特点及可靠性.用非亲缘个体的系列DNA混合体在体外检测此测定方法的可行性和半定量结果的准确性.结果表明,体外模拟混合嵌合体检测实验,显示扩增前供者DNA嵌合百分率与扩增后供受者DHPLC色谱峰峰面积比值呈直线相关,小检出DNA百分比为5%.用该方法分析51例移植对的结果显示:45例均至少有2个可以区分彼此的有信息位点(另外5例无移植前受者标本,1例为同卵双生双胞胎);39例与荧光标记多重PCR扩增STR结合毛细管电泳方法进行对照,准确性为100%;29例与性染色体FISH分析,27例与特殊基因标记的分析结果一致;所有病例均检测到完全供者细胞嵌合状态(FDC);对3例患者观察到临床复发的同时,检测到供者嵌合体的比例明显下降,其中2例为混合嵌合体,1例转变为受者自身型.在此基础上,我们将该方法首次用于对8例人类白细胞抗原(HLA)配型不同-单倍型亲缘供者干细胞及无血缘关系脐带血混合移植患者植活情况的动态检测.结果显示,8例混合移植患者STR-PCR检测结果均为FDC,来源均为亲缘供者.结论:用DHPLC技术结合短串联重复序列具有快速、经济、无污染和自动化高等特点,用于检测异基因造血干细胞移植物植活状态是可靠的.

  • 利用DNA池和变性高效液相色谱分析bcr和 abl基因序列标签位点多态性

    作者:田红;刘道明;徐兵;郑维扬;周淑芸

    为了探讨bcr和abl基因的单核苷酸多态性(SNP)与慢性髓细胞性白血病(CML)的关系,利用DNA池(DNA pooling)结合变性高效液相色谱(dHPLC)技术对bcr和abl基因上的9个序列标签位点(sequence-tagged site,STS)进行序列变异的筛查分析,并通过测序对筛查结果进行验证.研究结果表明,在9个STS片段中检出了4个片段中的多态性位点和3个片段中与参考序列不一致的变异.结论:U07000片段中的SNP在慢性髓性细胞白血病病人和对照人群中的基因频率分布有显著差异.

  • 应用变性高效液相色谱技术检测肥大细胞病c-kit基因突变

    作者:张凌岩;徐功立;Nicholas C.P.Cross

    本研究检测7例肥大细胞病患者c-kit基因激酶编码区突变情况,以探讨该基因变异在肥大细胞病诊断及治疗中的意义.应用PCR测定、变性高效液相色谱技术及DNA测序方法对患者进行c-kit基因外显子17~外显子19突变检测.结果表明:1例患者外显子17扩增产物在DHPLC中出现异常色谱峰,测序结果显示在外显子17出现A→T突变,即D816V;另2例患者外显子18/19经DHPLC检测,结果显示1个额外的色谱峰,测序结果证实在外显子18出现G→C改变,为同义突变L862L.结论:变性高效液相色谱技术是一种高效、可靠的突变检测方法,c-kit基因突变检测对肥大细胞病临床治疗有指导意义.

  • 多重PCR-DHPLC技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因型的方法学研究

    作者:徐君怡;曹际娟;郑秋月;王秋艳;刘淑艳;蒋丹

    目的 开发肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)检测方法 .方法 以编码大肠杆菌0157抗原的rfbE 基因、编码毒力因子的类志贺毒素(SLT)基因为目的 基因,选择2对引物,建立并优化了大肠杆菌O157:H7的多重PCR-DHPLC检测体系.扩增产物分别为224 bp和499 bp.结果 采用37株细菌验汪了该多重PCR具有良好的特异件.PCR榆测的灵敏度可达到4 CFU/ml.结论 实验证明,研究建立的多重PCR-DHPLC方法 可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测.

  • 运用变性高效液相色谱对肺炎克雷伯菌产ESBL进行基因分型

    作者:刘朝晖;王汉平;陈劲龙;杨银梅;叶惠芬;曾军

    目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的肺炎克雷伯菌临床分离株TEM型质粒进行基因分型,试图建立一种方便快捷的用于ESBL分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出TEM型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLC技术进行分析,分析提示,异常的样本通过测序确定其基因突变的类型,后通过比对确定其基因型.结果共分析了101例肺炎克雷伯菌临床分离株,全部样本均扩增出TEM型质粒的编码序列,经过DHPLC分析,52例(51.4%)样本表现为单一的洗脱峰,其形态与TEM-1标准菌株的峰型相一致,测序确定它们的碱基序列亦相一致,不存在变异,为TEM-1型;49例(48.6%)样本表现为异常的洗脱峰,它们均为双峰,形态一致,但异源双链峰的高度有差异,测序结果表明它们均存在四种相同的基因突变,在NCBI网站比对后确定为TEM-116;测序结果还提示,部分样本中TEM-1和TEM-116混合存在,其比例的不同表现为DHPLC时异源双链峰高度的差异;文献检索表明,本次确定的TEM-116为一新的基因亚型,为国内首次报道.结论DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,重复性好,不仅可对已知突变作出即时诊断,还可发现新的基因亚型,不失为一种较好的ESBL分子诊断方法及其流行病学监测手段.

  • 变性高效液相色谱技术快速检测下呼吸道致病性细菌的实验研究

    作者:张晓燕;刘朝晖;梁志科;王汉平;叶惠芬;杨银梅;谢健晋

    目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测5种下呼吸道致病性细菌,建立一种快速检测下呼吸道致病性细菌的分子生物学方法.方法 以下呼吸道致病性细菌16S rRNA基因的保守区设计通用引物,并在引物前加上40-bpGC,特异性扩增该基因的保守区和可变区,运用DH-PLC技术对PCR产物进行分析.选取50株临床分离菌株验证该方法的有效性.结果 通用引物可特异性扩增细菌16S rRNA,PCR产物经DHPLC分析后每种细菌均能得到特征性的洗脱峰.DHPLC检测临床分离菌株结果显示,与常规培养方法的符合率为100%.结论 DHPLC技术具有准确、简便、快捷和高通量等特点,在临床检测下呼吸道致病性细菌中具有潜在的应用价值.

  • 广州地区产ESBL肺炎克雷伯菌SHV型质粒的分子流行病学调查

    作者:刘朝晖;王汉平;杨银梅;左斌;叶慧芬

    目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术调查广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌各种亚型的流行分布情况,试图建立一种方便快捷的分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法 对73份产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌进行SHV质粒基因扩增,分别采用变性高效液相色谱(DHPLC)和测序法对扩增产物进行分析,以明确基因类型,并建立各个已知SHV基因亚型的特征性DHPLC图谱库.结果 73株产ESBL的肺炎克雷伯菌中68株确定为SHV基因型,其中62株为已知基因型,分别为SHV-1225株,SHV-1a 14株,SHV-17株,SHV-2a 8株,SHV-28 5株,SHV-2 2株,SHV-26和SHV-33各1株;6株为新的SHV基因型,其中5株获得命名;非SHV型菌株5株,分别为LEN-4型1株,OKP型4株.经过DHPLC分析,全部样本均表现为异常的洗脱峰,各种亚型的异常洗脱峰的形态迥异,其敏感性达100%(68/68),特异性为93.2%(68/73).SHV型质粒基因的突变集中在nt92、nt324~nt402及nt703~nt786这3个区段.结论 SHV-12是广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌主要的基因亚型,高比例基因变异的检出预示本地区即将或已经面临肺炎克雷伯菌新耐药机制的抵抗和流行,因此必须加强对产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测,及时调整抗菌策略;DHPLC可作为一种快速敏感的筛查方法用于产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测.

  • 变性高效液相色谱检测少突胶质细胞瘤1p杂合性缺失

    作者:李守巍;袁芳;江涛;王忠诚

    目的 建立临床检测少突胶质细胞瘤1p杂合性缺失的手段.方法 提取肿瘤组织及患者外周血DNA,利用聚合酶链式反应扩增微卫星位点后行变性高效液相色谱检测.结果 以患者外周血作对照,可明确显示肿瘤标本微卫星位点杂合性缺失情况,从而判断患者1p杂合性缺失情况.结论 该方法能直观便捷分析出患者1p杂合性缺失情况.

  • 变性高效液相色谱-测序技术在检测乳腺癌BRCA1基因突变中的临床诊断价值

    作者:李丹;吴永和;闵大六;汪朝晖;郑俊峰;孙大光;马旭

    目的 探讨变性高效液相色谱(DHPLC)-测序技术在早期检测乳腺癌BRCA1基因突变的临床意义.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增BRCA1基因,该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,直接进行DHPLC分析;有峰型改变的样本作测序分析,以确认突变.结果 从124例乳腺癌患者中共发现9种突变.包括7种错义突变,其中,1例Stop598,1例A807E合并E809L,1例A807E,2例Y856H,1例T967S,2例I1170F,1例R1203G;一种存在于一号内含子的突变,即IVS101-10 T>C17例;一种2号外显子的5'非翻译区突变,即A118T 2例.此外,在乳腺癌标本和正常对照标本中都发现有几处常见的单核苷酸多态性位点.结论 本研究确定了9种乳腺癌患者可能发生的突变类型,为今后临床应用DHPLC对高危人群BRCA1基因进行早期基因检测提供了9个位点.DHPLC-测序技术可快速、方便地区分带有碱基替换和小片段缺失的DNA片段,是一种可用于早期临床诊断乳腺癌BRCA1基因改变的高效、灵敏和操作简便的方法.

  • 我国东乡族Ghrelin基因Leu72Met多态性与2型糖尿病的关系

    作者:刘静;刘佳;马小琴;郭茜;李培强;刘菊香;张吉平;高静媛;谢小东;黄德珍

    目的 明确Ghrelin基因Leu72Met多态性在中国甘肃省东乡族的分布并探讨其与2型糖尿病的关系.方法 用PCR-DHPLC技术和测序法检测甘肃省东乡族T2DM患者及正常对照者(NC组)Ghrelin基因Leu72Met多态性.结果 Leu72Met基因型和等位基因频率在T2DM组和NC组中的分布差异无统计学意义(P>0.05);NC组CA+AA型的FIns、HOMA-IR明显高于CC型;T2DM组CC基因型的FPG、血肌酐(SCr)水平明显高于CA+AA型(P均<0.05).结论 Ghrelin基因Leu72Met多态性可能参与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制.

  • 变性高效液相色谱分析浙江沿海地区ESBLs基因类型研究

    作者:陈弘;郑昌华;王爱萍;江金彪;吴福根;秦涛;林应荣;茹彩旺;王玲

    目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型,了解浙江沿海地区ESBLs基因型分布情况.方法 对171株多药耐药肠杆菌科细菌进行表型确证试验,采用多重PCR对标准菌株和ESBLs表型阳性的临床菌株进行CTX-M扩增,扩增产物经DHPLC分析,通过与标准菌株色谱峰比对进行临床菌株基因分型.结果 171株多药耐药肠杆菌科细菌,有142株临床菌株ESBLs表型阳性,经多重PCR扩增142株肠杆菌科109株携带CTX-M基因,52株为CTX-M-1产物,57株为CTX-M-9产物,检出率达79.80%,其中大肠埃希菌携带CTX-M基因比例高,其次是肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌;109株临床菌株PCR产物经DHPLC分析检测出4种CTX-M基因型,33株携带CTX-M-3、19株携带CTX-M-15、5株携带CTX-M-9、52株携带CTX-M-14.结论 运用DHPLC技术检测出CTX-M型ESBLs菌株有4种基因型,其中CTX-M-14型是CTX-M型ESBLs主要型别;该地区细菌携带CTX-M型ESBLs以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌多见.

  • 运用变性高效液相色谱技术快速检测肺炎克雷伯菌耐药性

    作者:张盛斌;刘朝晖;杨银梅;王汉平

    目的 通过运用变性高效液相色谱(DHPLc)技术,对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的54株肺炎克雷伯菌临床分离株SHV型质粒进行基因分型,探讨其敏感性和特异性,试图建立一种快速检测肺炎克雷伯菌耐药性新方法.方法 利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出SHV型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLc技术进行分析和DNA测序,确定其基因突变的类型,后通过比对确定其基因型.结果 DHPLc分析样本的阳性率为100%,均表现为形态各异的异常洗脱峰(双峰或三峰);测序结果表明所有样本与SHV-1比较均存在着耐药基因突变;并且DHPLc中异常峰一致的样本均为同一基因亚型.结论 本次实验中DHPLc的敏感性高达100%,并且每一种SHV亚型具有特定的洗脱峰型,所以DHPLc可用于细菌耐药基因的分型,能快速检测肺炎克雷伯菌耐药基因的突变,不但准确性较高,而且具有简便快捷、经济等特点,有很大的潜在临床价值.

  • 变性高效液相色谱法分析中国人非小细胞肺癌、结直肠癌中表皮生长因子受体突变情况和临床意义

    作者:周冬辰;李龙芸;崔全才;王孟昭;张力;穆新林

    目的 初步了解我国NSCLC和结直肠癌患者EGFR突变的发生率及与此相关的临床特征.方法 利用含有野生型和突变型EGFR基因的质粒DNA,摸索条件,建立DHPLC佳检测方法;收集北京协和医院近期NSCLC手术标本和结直肠癌的石蜡标本,通过PCR和DHPLC筛查突变,测序验证,并对结果进行统计学分析.结果 在29例NSCLC标本中,8例发生突变,突变率为27.6%,其中6例为缺失突变、1例为点突变、1例为混合突变;8例女性中有7例发现突变,突变率为87.5%,而21例男性病人中只有1例发生突变,突变发生率为4.8%(P<0.001);8例无吸烟史的病人全部突变,突变发生率为100%,21例有吸烟史的病人无1例突变(P<0.001);20例腺癌病人中有8例突变,突变率为40.0%;9例鳞癌病人无一突变(P=0.026);肿瘤家族史和肿瘤分期则与突变无关.在37例结直肠癌标本中,未发现突变.结论 中国人NSCLC的EGFR突变发生率明显高于欧美国家,且以19外显子上的缺失突变为主.突变发生与女性、无吸烟史和腺癌有相关性,与肿瘤家族史和肿瘤分期没有相关性.结直肠癌EGFR未发现突变.DHPLC可作为EGFR突变筛查方法.

  • 胃癌线粒体D-loop(CA)n和ND1及ND5基因突变的研究

    作者:张伟;韩东升;任淑红;李大鹏

    目的:探讨胃癌线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变在胃癌发生发展中的作用.方法:利用激光显微切割技术分离胃癌组织及其切缘的正常组织,应用变性高效液相色谱技术DHPLC对胃癌线粒体D-loop调控区D-loop-(CA)n及电子传递链酶复合体Ⅰ的ND1和ND5基因进行突变筛查及测序分析.结果:胃癌组织样本中D-loop-(CA)n调控区、ND1和ND5基因突变率分别为50.8%(31/61)、39.3%(24/61)和21.3%(13/61),正常组织均未见有序列改变.胃癌组织D-loop-(CA)n调控区、ND1和ND5基因突变率与正常组织相比差异均有统计学意义,x2值分别为41.560、29.878和14.550,P值均<0.001.测序共鉴定出17个突变位点,11个位点为同义突变未引起氨基酸改变,6个位点为错义突变发生了氨基酸改变.mtDNA突变类型主要为碱基替代(76.5%,13/17),其中碱基转换和颠换各占23.5%(4/17)和52.9%(9/17).结论:胃癌mtDNA突变参与了肿瘤的发生发展.

  • DHPLC检测林州市高龄组和低龄组居民食管癌p53基因外显子突变谱的比较研究

    作者:杨胜利;谭家驹;徐致祥;杨劼;郭黎平;陆士新

    目的:研究我国食管癌高发区林州市居民高龄食管癌患者与低龄食管癌患者中抑癌基因p53全部编码外显子基因突变谱的情况,比较两组患者中p53基因突变的差异.方法:留取林州市>70岁和<40岁、低年龄组食管癌患者食管癌新鲜标本51例,提取DNA,PCR扩增p53第2~11外显子.DHPLC进行突变的筛查.突变样本进行DNA纯化测序分析.结果:51例患者中,p53至少有1个外显子基因突变的36例,突变率为70.6%.高年龄组突变率为63.3%(19/30),低年龄组突变率为80.9%(17/21),两者比较无统计学意义(P>0.05).p53有2个外显子基因突变的10例,突变率为17.6%.高年龄组突变率为26.7%(8/30),低年龄组突变率为9.5%,两者比较无统计学意义,P>0.05.结论:p53基因突变是林州市居民食管癌发生过程中的一个发生频率很高的事件.林州市居民的p53外显子突变谱中,共有15种突变类型,共计59个突变位点,其中多的突变类型是插入碱基C.在p53基因第2~8外显子与内含子交界的非编码区有大量的基因突变.

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