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共刺激分子PD-L1、PD-L2和B7-H4在宫颈癌中的表达及病理特征研究
目的:探讨共刺激分子PD-L1、PD-L2和B7-H4在宫颈癌中的表达及病理特征.方法:收治宫颈癌患者35例作为试验组,另选择宫颈上皮组织正常患者34例作为对照组.结果:PD-L1、B7-H4在正常宫颈中几乎不表达,在上皮细胞瘤变组织中PD-L2和B7-H4值与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);患者的肿瘤浸润度>10 mm的组织中,PD-L1的表达情况明显高于浸润的深度,其高出的部分≤10 mm(P<0.05);发生淋巴转移患者组织中PD-L2的表达情况明显高于无淋巴转移者(P<0.05);淋巴癌患者的宫颈癌组织中的B7-H4表达情况明显高于淋巴转移者(P<0.05).结论:宫颈癌患者高表达与肿瘤的淋巴侵袭力以及转移有关,即PD-L1、PD-L2和B7-H4发生高表达现象.
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人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及真核细胞的表达
目的:通过构建重组的人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白.为PD-1的生物学活性研究奠定基础.方法:根据人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段.以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1.脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72小时的细胞上清.western Blot方法鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性.结果:通过EcoR1/BamH1双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确.重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性.结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础.
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放射免疫分子探针131I-PD-L1mAb的制备及体内显像实验
目的 研制新型放射免疫分子探针131I-PD-L1mAb,在探索分子探针理化性质及体内安全性的基础上,开展荷瘤裸鼠在体靶向显像研究.方法 优化放射性核素碘-131[131I]标记抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)的标记条件,测定分子探针131I-PD-L1 mAb在不同环境下的稳定性,并观察其急性毒性反应与致热原.静脉单次给药后,按不同时间点抽血测放射性计数,根据非房室统计矩模型进行曲线拟合并计算药动学参数.建立荷U87裸鼠模型,进行体内肿瘤靶向性显像研究.结果 分子探针131I-PD-L1 mAb的标记率为(80.21 ±2.98)％,放射化学纯度达(96.51±1.10)％.131I-PD-L1 mAb的放化纯在72h内均大于92％,放射稳定性良好,且亲水性较强(LgP=-2.51±0.39).该探针无急性毒性反应及致热原.半衰期T1/2与血药浓度-时间曲线下面积AUC0-inf分别为15.53 h与814.16 kbq/mL×h.荷瘤裸鼠体内显像结果显示:荷U87实验组的肿瘤部位可见清晰显影,144h时肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值达10.32±0.78(n =3);而阻断组的肿瘤部位未见明显放射性浓聚,T/NT比值分别为1.14±0.20(n =3).结论 131I-PD-L1 mAb标记简单,放化纯高,稳定性良好,特异性显像效果良好,体内应用安全,有望进一步应用于肿瘤的放射免疫显像与治疗研究.
关键词： PD-L1 碘-131[131I] 分子探针 分子影像 肿瘤免疫 -
EGFR突变型非小细胞肺癌中PD-1、PD-L1表达的研究进展
继酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)靶向治疗之后,免疫治疗现已成为非小细胞肺癌冶疗的新研究热点.免疫治疗相关蛋白PD-1和PD-L1与EGFR突变相关的研究,可能为两种治疗方式在临床中的联合应用提供相关的理论基础.本文就目前EGFR突变型非小细胞肺癌中PD-1、PD-L1表达的新研究进展作一汇总.
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PD-L1与记忆性T细胞在肝囊型包虫病患者CD4+T淋巴细胞中的表达及意义
目的 检测程序性死亡受体配体-1(PD-L1)及记忆性T细胞在肝囊型包虫病患者CD4+T淋巴细胞中的表达,探讨其在细粒棘球蚴感染免疫逃避中的作用. 方法 具有包虫活性的肝包虫病患者42例,健康对照20例,取血,分离PBMC,流式细胞术检测PD-L1 (CD274+)、CD45RO+及CD4+ CD45RO+ CD274+细胞比例,并分析PD-L1与CD45 RO的相关性. 结果 肝囊型包虫病患者PBMC中PD-L1、CD45RO+及CD4+ CD45RO+ CD274+细胞比例均显著高于健康对照组(P＜0.05);肝囊型包虫病患者的PD-L1与CD45RO呈显著正相关(P＜0.05),健康对照组二者无显著相关关系(P＞0.05). 结论 在肝囊型包虫病患者的免疫反应中,PD-L1可能通过记忆性T淋巴细胞发挥促进包虫免疫逃避的作用.
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BCL-2与PD-L1联合检测在预测初治急性白血病预后中的价值分析
目的:探讨BCL-2与PD-L1联合检测用于初治急性白血病患者预后评估的临床价值.方法:选取本院血液科2013年1月至2016年9月收治的100例初治急性白血病患者,采用RT-PCR法检测患者骨髓分离细胞中BCL-2及PD-L1的mRNA表达水平,并对患者的预后进行随访.根据随访结果将患者分为完全缓解组与未完全缓解组,统计并分析不同指标预测患者预后的约登指数.结果:与健康对照组相比,AL患者骨髓标本BCL-2、PD-L1阳性表达率均显著升高(P＜0.01).BCL-2单独检测预测患者预后显示,曲线下面积(AUC)为0.725(P=0.006),判断阈值为1.550,Sen和Spe分别为72.0％和84.0％.PD-L1单独检测预测患者预后显示,AUC为0.740(P=0.004),判断阈值为12.500,Sen和Spe分别为66.7％和73.1％.两者联合检测显示,并联检测诊断指数为77.90,高于串联检测54.75,亦高于2项指标单独检测的诊断指数.结论:BCL-2联合PD-L1检测应用于初治急性白血病患者的预后评估,能够提升检测的特异度和敏感度,较2者单独检测有更高的诊断指数(约登指数),在临床评估急性白血病患者预后中有一定临床价值.
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PD-L1、HSP90及HSP90α在急性白血病患者中表达及其意义
目的:探讨PD-L1、热休克蛋白90(HSP90)和热休克蛋白α(HSP90α)在急性白血病(AL)患者不同类型及不同疾病阶段表达情况及其临床意义.方法:选取2013年1月至2016年10月医院收治的84例急性白血病患者和选择体检健康者20例作为对照组,收集他们的血清及骨髓样本,应用ELISA法测定HSP90、HSP90α蛋白水平,流式细胞术检测PD-L1表达,分析患者临床转归与PD-L1、HSP 90和HSP90α表达的关系.结果:各组AL患者PD-L1阳性率、HSP90和HSP90α蛋白表达水平均显著高于对照组(P＜0.05),缓解期患者的PD-L1阳性率、HSP90和HSP90α蛋白水平均低于初治期患者(P＜0.05),复发患者的PD-L1阳性率和HSP90及HSP90α蛋白水平均高于初治及缓解期患者(P＜0.05),初治AML与初治ALL患者的PD-L1阳性率、HSP90蛋白水平无显著性差异(P＞0.05),初治AML患者HSP90α蛋白水平低于初治ALL患者(P＜0.05);患者经治疗后,未缓解患者PD-L1阳性率、HSP90及HSP90α蛋白水平显著高于完全缓解患者(P＜0.05);未复发患者化疗过程中HSP90α蛋白表达逐渐降低,造血干细胞移植术后患者HSP90α蛋白表达低,复发前HSP90α蛋白表达增加,复发后水平达高峰.结论:PD-L1、HSP90和HSP90α在急性白血病发展过程中发挥重要作用,可作为评估患者临床疗效及预后的参考指标.
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PD-L1在急性白血病中的表达及其临床意义
目的:探索PD-L1在急性白血病中的表达情况,探讨PD-L1的表达与与患者的临床特征及预后之间的关系.方法:应用流式细胞术检测75例患者(包括59例初治患者和16例复发难治患者)骨髓原始细胞中PD-L1的表达情况,并搜集患者的临床资料,追踪初治组患者的治疗效果.结果:PD-L1在白血病细胞中表达的总体阳性率为32.0％ (24/75),其中在急性单核细胞白血病中的表达高于在其他白血病类型中的表达水平[56.3％ (9/16) vs25.4％ (15/59)],其差异有统计学意义(P =0.019),在复发难治组中PD-L1阳性率高于初治组[56.3％ (9/16) vs25.4％ (15/59)],其差异具有统计学意义(P=0.019);在59例初治患者中PD-L1阳性组1个疗程CR率低于PD-L1阴性组(66.7％vs71.4％),2个疗程CR率低于PD-L1阴性组(70％ vs 88.6％),PD-L1阳性组半年复发率高于PD-L1阴性组(20％vs8.82％),阳性组难治患者比例高于PD-L1阴性组(30％vs14.3％);PD-L1的表达与患者的性别、年龄、髓外浸润、骨髓中原始细胞比例、初诊血象(白细胞、血红蛋白、血小板水平)等临床特征无显著相关性,与AML患者的分子生物学突变及细胞遗传学危险度分组之间也无显著相关性.结论:PD-L1在急性白血病中有表达,可能参与白血病细胞的免疫逃逸及原发耐药机制,并可能成为评估患者预后及复发的指标.
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PD-L1在淋巴瘤中的表达及其对淋巴瘤增殖和化疗抵抗的初步研究
为了研究PD-L1(programmed death 1-1igad)对淋巴瘤增殖及对化疗药物的影响,探讨新的治疗方法,应用免疫组织化学方法和流式细胞术检测了PD-L1在淋巴瘤组织及细胞系中的表达情况,用流式细胞术分选的方法得到了高表达和低表达PD-L1的2组A20细胞株,将A20淋巴瘤细胞株接种到BALB/c小鼠身上构建荷瘤小鼠模型,观察肿瘤生长情况,后检测了PD-L1对淋巴瘤常用化疗药顺铂的杀伤作用的影响.结果表明,PD-L1在淋巴瘤组织和细胞株中广泛高表达.应用流式细胞术筛选的PD-L1高表达细胞株在体内成瘤作用强于PD-L1低表达细胞株.结论:PD-L1可促进肿瘤的生长,同时通过抗凋亡抵制顺铂对肿瘤的杀伤作用.
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PD-L1阻断对慢性髓系白血病源性树突状细胞的功能影响
程序性死亡-1配体-1(PD-L1)作为近年来发现的B7家族新的成员,已被证实有免疫负调节作用,白血病源性树突状细胞(DC)高表达PD-L1可能是影响其功能的原因之一,本研究试图阻断PD-L1在DC上的表达以增强白血病源性DC的免疫刺激功能.应用人rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-α细胞因子组合诱导慢性髓系白血病细胞(CML)分化DC,观察给予加或不加PD-L1单克隆抗体对DC的影响.应用流式细胞术检测DC免疫表型及PD-L1,MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力,ELISA法测定上清液中IFN-γ、IL-2和IL-10的水平.结果显示,负性调节分子PD-L1随着慢性髓系白血病源性树突状细胞(CML-DC)成熟表达不断升高,阻断PD-L1能增强CML-DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力,促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2并抑制IL-10的产生(p＜0.05).结论:阻断PD-L1可增强白血病源性DC的功能,为白血病DC瘤苗治疗技术提供了新的方法.
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分泌型PD-L1真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究
目的 构建分泌型PD-L1真核表达载体,并对其生物学活性进行初步研究.方法 以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)配体PD-L1的胞外段基因片段,定向连接于pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1;用脂质体将重组子导入NIT细胞,转染后的NIT命名为NITp.以Western blot鉴定重组蛋白的表达.MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合淋巴细胞培养反应的影响;用ELISA试剂盒检测NITp细胞培养上清对反应性T细胞分泌的细胞因子的影响.结果 RT-PCR得到约730bp目的基因片段,测序结果显示该目的基因与Gen-Bank上的序列相符;Western blot分析提示NITp分泌性表达目的蛋白;NITp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖,其效应呈剂量依赖性;反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示,培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低,与正常对照组差异有统计学意义.结论 成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1,PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化.
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PD-L1信号对T细胞体外激发的调节作用
目的探讨PD-L1信号在PHA体外激发体系中对人外周血T细胞的协同调节作用.方法采用10μg/ml PHA刺激人外周血T细胞体外培养体系,加入转基因细胞PD-L1/L929混合培养;免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型及细胞周期;3H-TdR掺入法观察T细胞的增殖;ELISA法检测T细胞对IL-2和IFN-γ的产生.结果 PD-L1转基因细胞在PHA激发T细胞增殖的培养体系中,具有显著下调T细胞活化表型,抑制T细胞对PHA促增殖的反应性,这种抑制效应与其阻断T细胞于G0/G1细胞周期及使活化T细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平下降有关.同时还发现PD-L1信号能抑制PHA介导的T细胞活化诱导凋亡.结论 PD-L1信号在体外PHA激发T细胞培养体系中,具有显著的负性调节其活化增殖和相应功能的作用.
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PD-1/PD-L1在儿童结核病中的表达研究
目的 研究负性协同刺激分子PD-1/PD-L1在小年龄儿童(≤5岁)结核病中的表达情况,探讨其在儿童结核病中的免疫作用.方法 结核病儿童36例和健康儿童20例(均≤5岁),取外周血5 ml,用淋巴细胞分离液分离PBMC,通过实时荧光定量PCR法检测PD-1/PD-L1 mRNA表达水平.结果 结核病儿童和健康儿童外周血PD-1/PD-L1表达水平进行比较,无论是肺结核还是肺外结核,患儿外周血中PD-1/PD-L1基因表达水平均升高(P＜0.05),其中PD-L1的基因表达水平升高更明显,PD-1表达水平略低于PD-L1.结论 本研究提示小年龄结核病儿童,无论是肺结核还是肺外结核,外周血PD-1/PD-L1基因表达水平均升高,提示PD-1/PD-L1可能在小年龄儿童结核病致病机制中起着重要的作用.
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B7-2和PD-L1 mRNA表达在慢性乙型肝炎免疫耐受中的意义
T淋巴细胞介导的细胞免疫反应是乙型肝炎病毒(HBV)感染的主要免疫反应,而T细胞的活化依赖于双信号的刺激,第一信号来自抗原,第二信号由共刺激分子提供.B7-2(CD86)和PD-L1(B7-H1)是正负共刺激分子的代表,B7-2组成型表达于抗原提呈细胞上,上调速度非常快,迅速促进T细胞的分化和产生效应[1];PD-L1被广泛地诱导性表达在身体各器官组织中,对免疫应答起负性调控作用,减弱T细胞的免疫应答,是诱导免疫耐受和T细胞凋亡的主要共刺激分子[2].
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CTLA-4和PD-1：恶性淋巴瘤免疫治疗中潜在的作用靶点
人体免疫系统具有根除病原体同时限制自身过度炎症反应,避免周围组织损伤的重要调节功能。这种免疫自限性平衡主要由抗原提呈细胞( antigen presentation cell,APC)和T细胞之间复杂的相互作用而控制。然而在恶性肿瘤中,该免疫平衡被破坏,导致肿瘤细胞发生免疫逃逸,进而致使肿瘤细胞无限增殖甚至转移,或者促进肿瘤细胞耐药性。其中免疫检查点扮演着关键作用。因此靶向这些免疫检查点,阻断肿瘤细胞免疫逃逸成为当前复发/难治性恶性肿瘤治疗的研究热点。在恶性淋巴瘤中,目前一些关于免疫检查点抑制剂的Ⅰ/Ⅱ期临床研究正在进行或已结束,并取得了令人惊喜的疗效,其治疗前景值得期待。本文将对恶性淋巴瘤的免疫检查点在微环境中的调节及以其为靶点的新临床治疗进展做一综述。
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肺腺癌组织PD-1、PD-L1表达水平对晚期肺腺癌放化疗后预后判断的价值
目的 探讨肺腺癌组织程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体(PD-L1)表达水平对晚期肺腺癌放化疗后预后判断的价值.方法 回顾性分析2016年1月至2017年12月广西钦州市第二人民医院初治确诊的肺腺癌患者114例的病例资料.对比分析肺腺癌组织PD-1及PD-L1表达阳性与晚期肺腺癌放化疗3个月预后的相关性.结果 晚期肺腺癌组织PD-1或者PD-L1表达阳性的患者在放化疗3个月后预后效果均显著低于PD-1或者PD-L1表达阴性的患者,差异均具有统计学意义(P ＜0.05).结论 阻断PD-1与PD-L1结合的治疗方案对于晚期肺腺癌组织PD-1或者PD-L1表达阳性的患者可能获得更好的临床获益,需引起临床上引起重视.
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重组腺病毒Ad-PD-L1转染供体小鼠树突状细胞对受体小鼠淋巴细胞激活的影响
目的:观察重组腺病毒载体Ad-PD-L1转染供体C57BL/6(H-2b)小鼠树突状细胞(DC)对受体DBA/2(H-2d)小鼠淋巴细胞增殖和激活的影响.方法:构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-GFPCMV(-)-PD-L1和腺病毒骨架质粒pAdxsi-GFP-CMV-PD-L1,重组腺病毒Ad-PD-L1进行包装、扩增和纯化.分离培养供体C57BL/6小鼠的DC,分为3组:腺病毒载体Ad-PD-L1转染组(A组),空载体转染组(B组)和对照组(C组).Western blot检测转染后各组细胞PD-L1的表达.分离受体DBA/2小鼠的淋巴细胞,用羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,将供体C57BL/6小鼠的DC和受体DBA/2小鼠淋巴细胞混合培养,流式细胞仪观察淋巴细胞的增殖情况.结果:酶切及测序证实含PD-L1的重组腺病毒载体Ad-PD-L1构建成功.转染供体C57BL/6小鼠的DC后其PD-L1的表达升高37% (P<0.05),将转染了PD-L1的DC与受体DBA/2小鼠的淋巴细胞进行共培养.与对照组相比,PD-L1表达升高后,明显地抑制了淋巴细胞的增殖和活化.受体DBA/2小鼠的淋巴细胞增殖降低41% (P<0.01).结论:转染供体C57BL/6小鼠DC后通过共刺激通路PD-1/PD-L1抑制了受体DBA/2小鼠淋巴细胞的增殖和激活.
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MMR与PD-L1在Ⅱ期术后结直肠癌中的差异性表达
目的 探讨错配修复基因(MMR)和细胞程序性死亡配体1(PD-L1)在Ⅱ期结直肠癌(CRC)组织中的一致性及差异性.方法 选取2016年1月到2017年10月接受手术治疗的Ⅱ期CRC患者50例,免疫组化法检测术后病理组织标本中4种MMR蛋白:MutL同源蛋白1(MLH1)、Muts同源蛋白2(MSH2)、Muts同源蛋白6(MSH6)、减数分裂后分离蛋白2(PMS2)和PD-L1的表达,并分析二者的相关性.结果 结直肠癌组织中MMR缺失(dMMR)率和PD-L1的阳性率分别为32％(16/50)和38％(19/50),dMMR和PD-L1双阳性的患者为20％(10/50);dMMR患者中PD-L1的阳性率高于错配修复功能完整患者,62.5％(10/16)vs 26.5％(9/34),差异具有统计学意义(χ2=5.995,P=0.027),PD-L1的表达与MLH1和MSH2表达缺失有关(P=0.024和0.049);PD-L1阳性患者(n=19)中dMMR与错配修复功能完整的发生率差异无统计学意义,52.6％vs 47.4％.结论 PD-L1蛋白与dMMR存在差异性表达,在使用靶向药物治疗前,应综合考虑两种生物标志物的表达情况更精准地筛选患者.
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B7家族在非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义
目的：检测B7家族在非霍奇金淋巴瘤（ NHL）中的表达，阐明其在NHL中的作用及意义。方法应用密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞（ PBMCs），实时荧光定量PCR（ RQ-PCR）检测B7家族PD-L1和PD-L2 mRNA在B细胞淋巴瘤（B-NHL）、T细胞淋巴瘤（T-NHL）及NK/T细胞淋巴瘤（NKTL）细胞系中的表达水平。结果 PD-L1和PD-L2 mRNA在NHL各细胞系中呈不同程度表达，T-NHL及NKTL细胞系中其表达量均明显高于正常PBMCs（P＜0.05），而B-NHL细胞系中PD-L1和PD-L2 mRNA表达量与正常PBMCs相比无明显差异（ P＞0.05）。结论在NHL中， B7家族中PD-L1及PD-L2可能参与了NKTL及T-NHL肿瘤的免疫逃逸，有望成为NKTL及T-NHL肿瘤免疫治疗的新靶点。
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B7-H1与移植免疫
B7-homolog 1(B7-H1)是迄今发现的B7家族中较新的共刺激分子.它对T细胞具有双重效应,可以激活初始T细胞,抑制活化的效应T细胞.参与多种免疫过程的发生.在一些动物器官移植模型研究中,发现B7-H1在抑制免疫排斥,诱导免疫耐受,保护移植物中有重要的作用.以B7-H1为靶点的干预方法在未来可能成为器官移植后免疫抑制治疗的有效方法.本文就B7-H1在移植免疫中作用的研究进展做一综述.
