首页 > 文献资料
-
信号通路抑制剂和饲养层对猪胚胎生殖细胞建系的影响
胚胎生殖细胞(EGCs)是原始生殖细胞(PGCs)在体外特定条件下,经重编程而形成的、具有和胚胎干细胞(ESCs)相似特性的多能性干细胞.猪EGCs的研究在利用EGCs进行核移植、生产转基因动物以及建立生物反应器方面具有广阔的应用前景.然而到目前为止真正意义上的猪EG细胞系还没有建立,体外培养条件不确定是影响猪EGCs建系的重要因素之一.本研究探讨了猪PGCs体外培养过程中不同信号通路抑制剂以及不同饲养层对其重编程形成EGCs的影响,确定了CHIR99021、SB431542和小鼠成纤维细胞制作的饲养层组合,能够较大程度维持PGCs的增殖及存活能力,实现向EGCs的重编程.
-
全能干细胞分化的研究进展
对于全能干细胞的分化研究目前已成为当今医学界研究的热点,但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题,近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展.本文重点将这三种全能干细胞从其分化机制、定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述.
-
人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长
目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件.方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6～11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达.结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞.分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代.集落未分化标志检测显示SSEA-1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性.结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞.
-
小鼠胚胎生殖细胞系的建立及其印记状态
目的 成功建立小鼠胚胎生殖细胞(EGCs)系,并初步分析小鼠胚胎生殖细胞的印记状态.方法 建立交配后12.5d(12.5dpc)原始生殖细胞(PGCs)来源的小鼠EGCs,通过碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫荧光细胞化学、体内分化及体外分化等方法检测EGCs的多能性,并以小鼠胚胎干细胞(ESCs)为对照,应用Real-time PCR检测EGCs中与发育相关的Ins2、Lgf2、H19、Lgf2r等11个父源与母源印记基因的表达情况.结果 成功建立小鼠EG细胞系,EGCs克隆AKP染色显示有高水平的AKP活性,免疫荧光细胞化学方法显示克隆表达小鼠ESCs多能性标记物Oct4及细胞表面标记SSEA-1.核型分析检测显示,小鼠EGCs为正常的40条染色体,体内可分化出3个胚层来源的组织,说明小鼠EGCs具有多能性；Real-time PCR结果显示EGCs的印记基因表达量显著高于ESCs.结论 12.5dpc PGC来源的EGCs的印记基因处于擦除状态.
关键词： 胚胎生殖细胞 印记基因 实时定量聚合酶链反应 小鼠 -
SSEA-1、Oct-4在人胚胎生殖细胞的表达
目的体外培养人胚胎生殖细胞(EG细胞),通过检测培养的细胞中SSEA-1、Oct-4的表达,鉴定人胚胎生殖细胞.方法取5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养,采用流式细胞术及免疫细胞化学检测培养细胞的SSEA-1、Oct-4表达;取5～9周人胚胎的生殖腺嵴,制备石蜡切片,利用免疫组织化学方法,检测原始生殖细胞的SSEA-1表达.结果组织块体外培养得到的细胞,经免疫细胞化学及流式细胞仪显示的单个细胞或细胞集落,均阳性表达SSEA-1、Oct-4.石蜡切片免疫组织化学显示,人胚胎生殖腺嵴中有许多SSEA-1阳性表达的原始生殖细胞.结论组织块体外培养所获得细胞来源于原始生殖细胞,为未分化的人胚胎生殖细胞.
-
实验用五指山小型猪胚胎生殖细胞的分离培养
目的 对从猪的原始生殖细胞分离获得胚胎干细胞的方法进行初步研究.方法 胎儿取自怀孕26～28 d的实验用五指山母猪.分离胎儿生殖嵴获得PGCs,接种于STO饲养层上,以DMEM+2 mmol/L谷氨酰胺+0.1 mmol/L非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+100 IU/mL青霉素+100 pg/mL链霉素+15%FCS作为培养基,对细胞进行培养传代.结果 培养的细胞传至4～5代,形态多样,经AKP染色、SSEA-1免疫荧光染色、Oct-4免疫荧光标记等方法鉴定为阳性,具有胚胎干细胞的特征.
-
松果体区生殖细胞肿瘤10例临床分析
生殖细胞肿瘤是指发源于胚胎生殖细胞的肿瘤,占颅内肿瘤的0.5%～2%,70%发病于10～21岁,男女发病率约2:1,主要位于中线部位,较常见于松果体区及鞍上区.根据2007年世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类,生殖细胞肿瘤包括生殖细胞瘤、胚胎性癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤和混合性生殖细胞肿瘤等共6种病理类型.
-
胚胎源性干细胞特性及组织工程应用前景
种子细胞来源不足是目前限制组织工程发展的瓶颈问题,而免疫排斥则是限制器官和组织移植成功的一个重要原因.胚胎干细胞的多向分化潜能和无限扩增能力,结合细胞核移植技术使胚胎源性干细胞有希望同时解决这两个难题.本文综述了几种胚胎来源干细胞以及它们的生长特性、表面标志和体外诱导分化,并对其组织工程应用前景进行展望.
-
胚胎源性干细胞分化研究的现状
目前,对于胚胎源性干细胞的分化研究已成为当今医学界研究的热点,但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题,近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展.将这三种胚胎源性干细胞从其分化机制及定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述.
-
生殖细胞瘤的伽玛刀治疗
生殖细胞瘤是来源于原始胚胎生殖细胞的肿瘤.发病率占颅内肿瘤的0.5%～2%,主要发生于松果体区,其次是鞍上池,也可发生于第三脑室、下丘脑及视交叉等部位.发病年龄多在10～20岁之间.松果体区生殖细胞瘤以男性多见,鞍上池生殖细胞瘤以女性多见.生殖细胞瘤是高度恶性肿瘤,多呈球形、浸润性生长,也可沿脑室壁匍匐生长,其主要临床表现为:1.颅高压症状,如头痛、恶心、视乳头水肿;
-
人胚胎干细胞分化研究进展
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ES细胞)是由着床前囊胚期内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)建立的、可在体外未分化状态下长期增殖传代的、具有稳定的二倍体核型和多能干细胞表面特异抗原标记的、可分化为3个胚层来源的各种组织和细胞类型(包括生殖腺和生殖细胞)的永久细胞系.基于其特性,目前普遍认为,.ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,新基因的发现,药物的筛选和致畸实验及作为细胞组织移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响.本文综述了人胚胎干细胞诱导分化研究进展.
-
胚龄及分离方法对小鼠胚胎生殖细胞扩增效率的影响
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.
-
胚胎干细胞与胚胎生殖细胞的生物学特性及应用前景
目的:分析胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养条件、周围微环境对其增殖分化的影响,了解胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的关系和应用前景.方法:应用计算机检索万方数据库2000/2007有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的相关研究文章,检索词:生殖细胞,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞,并限定文章语言种类为中文;同时应用计算机检索PUBMED2000/2006相关文章,检索词:Germ Cells,Primordial germ cells,Embryonic stem cells,Embryonic Germ Cells,限定文章语言种类为"English".对资料进行初审,纳入标准为有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养及生长抑制因子的作用等相关文章,并查找全文.主要选择基础研究类文章,无论有无对照组均纳入.结果:共检索到相关文章59篇,排除比较陈旧的文章,后纳入38篇进行总结分析.胚胎干细胞与胚胎生殖细胞分别从附置前早期胚胎内细胞团和早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞分离克隆出来,均具有自我更新、无限增殖能力及多向分化潜能,在体外培养条件下可保持稳定的二倍体核型,诱导分化后可形成3种胚胎生殖层.饲养层细胞是人胚胎生殖细胞体外培养的必要条件,常用饲养层细胞有鼠STO细胞系、鼠胚胎成纤维细胞,体外生长所需主要细胞因子包括干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子,然而只要在培养基中加入鼠成纤维细胞的上清液和碱性成纤维细胞生长因子,胚胎干细胞可在无饲养层的条件下进行体外培养.结论:胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有相似的增殖特性,一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞,并可相互转变,在胚胎发育、基因治疗、药物筛选、新药开发、生殖医学及人类疾病的移植治疗中具有广泛的应用前景.
-
人胚胎干细胞体外培养并分化为心肌细胞
目的:体外培养并鉴定人胚胎干细胞(EG细胞),在不添加细胞因子的条件下,观察细胞集落分化情况.方法:取4～6周人胚胎生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴,进行组织块培养,利用组织化学和免疫组织化学技术对培养的细胞进行鉴定.结果:培养7～8小时,在组织块周围出现成纤维细胞;5～7天后,在成纤维细胞上出现EG细胞集落,集落内细胞表达阶段特异性胚胎表面抗原SSEA-1和SSEA-3,并表达碱性磷酸酶(ALP)活性;培养18天后,有6个集落分化为有节律跳动的心肌细胞,这些细胞集落在继续培养15天后,仍能有节律收缩.此时集落内细胞ALP表达呈阴性,但仍有少量细胞表达SSEA-1和SSEA-3.结论:体外培养人胚生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴组织块,以内源性的成纤维细胞作为饲养层,可以分离得到EG细胞集落,一些EG细胞集落可以自发地分化成心肌细胞.
-
胚胎干细胞和异种器官移植--21世纪移植免疫学面临的挑战
1998年美国Thomson和Gearhart两个实验室分别报告人体胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎生殖细胞(EC细胞)建系成功,由此激起人体ES细胞定向分化的研究.美国<时代>周刊将此列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪具发展和应用前景的领域.
-
人类胚胎干细胞研究的伦理学思考
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是从早期胚胎中发现的能在体外培养的一种高度未分化细胞,具有多向分化潜能,可无限增殖及诱导分化成几乎机体所有类型的细胞,按组织来源可分为由早期胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)分离的ESCs和胚胎生殖细胞(emlbryonic germ cells,EGCs),通常所讲的ESCs即由早期胚胎ICM分离的ESCs.
-
人胚胎生殖细胞移植大鼠急性心肌梗死区的存活及分化
目的 观察人胚胎生殖细胞移植于大鼠急性心肌梗死区后的存活率和增殖分化能力,探讨人胚胎生殖细胞异种异体移植的可行性.方法 取5～9周人胚胎生殖脊细胞,分离、体外培养获得胚胎生殖细胞;用SD大鼠建立心肌梗死模型,分为对照组、移植组.分别在移植后1 d和1、2、4周处死大鼠,以抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂,观察转录因子Nkx-2.5在移植大鼠心脏组织的阳性表达;分析人胚胎生殖细胞在宿主体内转化为心肌细胞的能力.结果 成功建立大鼠心肌梗死模型;移植组心肌梗死区抗人细胞核抗体MAB1281和转录因子Nkx-2.5均呈阳性表达,对照组均为阴性表达.结论 人胚胎生殖细胞植入心肌组织后,不仅在心肌内存活而且表现出向心肌细胞分化的特性.
-
转录因子Oct-4和端粒酶在人胚胎生殖细胞的表达
目的 体外培养人胚胎生殖细胞(EGC),通过检测培养的细胞中转录因子Oct-4、端粒酶的表达,鉴定EGC.方法 取5～10周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养,采用免疫细胞化学检测Oct-4、端粒酶表达.结果 组织块体外培养得到的细胞,经免疫细胞化学法显示的单个细胞或细胞集落,均阳性表达转录因子Oct-4、端粒酶.结论 组织块体外培养所获得细胞来源于原始生殖细胞(PGCs),为未分化的EGC.
-
人胚胎生殖细胞的传代培养
目的 探求人胚胎生殖细胞适宜的传代时间及佳的传代方法.方法 取8周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养人胚胎生殖细胞,选择原代培养第8天和第16天的细胞,采用挑取传代法和消化传代法,其中的消化传代法采用三种不同的消化液进行传代培养,记录各代培养的细胞集落数.结果 在原代培养第8天时,挑取传代法传2代后获得的细胞集落数减少;消化传代法传4代后获得的细胞集落数明显增多.原代培养第16天时未能传代培养,但却看到人胚胎生殖细胞集落的分化.结论 人胚胎生殖细胞传代培养适宜的传代时间为原代培养第8天,佳的传代方法为消化传代法.
-
人原始生殖细胞的分离和培养
目的 探讨体外分离培养人原始生殖细胞的条件和方法.方法 分离、培养2～3个月人胚胎的成纤维细胞,经60Co照射后作为饲养层;从5～9周人胚胎的生殖嵴和肠背系膜组织中分离原始生殖细胞,培养在含有bFGF、LIF和Forskolin的人胚胎成纤维细胞饲养层上;同时采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测人原始牛殖细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4以及特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZL的表达,并进行类胚体培养.结果 分离的人原始生殖细胞在饲养层上可以增殖形成典型的鸟巢状集落;细胞染色体均为正常的二倍体核型;阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性,同时检测到生殖干细胞特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZI.表达.人原始生殖细胞在悬滴培养时能够形成类胚体,表明其具有多项分化潜能.结论 用人胚胎成纤维细胞作为饲养层进行体外培养人胚胎生殖嵴和肠背系膜组织,分离的原始牛殖细胞形成EG细胞集落,初步鉴定为人胚胎生殖细胞.
