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人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及真核细胞的表达
目的:通过构建重组的人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白.为PD-1的生物学活性研究奠定基础.方法:根据人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段.以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1.脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72小时的细胞上清.western Blot方法鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性.结果:通过EcoR1/BamH1双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确.重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性.结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础.
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人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及Cos-7细胞的表达
目的:构建重组人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白.为PD-1的生物学活性研究奠定基础.方法:从GenBank里查到人PD-J胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段.以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1.脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72 h的细胞上清.用Western blot鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性.结果:通过EcoR I/BamH I双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确.重组质粒在Cos-7/细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用Western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性.结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础.
