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  • PCR检测技术在尖锐湿疣诊断中的应用

    作者:孙朋

    探讨在尖锐湿疣临床诊断检测中的更灵敏的方法.免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术.

  • 单核苷酸多态性基因分型技术与人类营养风险评估

    作者:张春红;霍军生;孙静;黄建

    单核苷酸多态性位点(SNP)以遗传标记密度高、稳定性高及分型检测易于实现自动化的特点成为第3代多态性标记,在遗传诊断、遗传风险评估,连锁不平衡图谱和遗传关联分析等人类基因组学研究领域显示了强大的应用前景.本研究以原理为主线,从通用步骤中DNA片断PCR扩增,SNP鉴别反应和SNP检测识别机制三大方面剖析了SNP基因分型技术领域研究进展,后指出了适合于我国营养素缺乏风险评估项目的SNP基因分型新技术应具有的特点.

  • 新疆4种绢蒿属植物及近缘种银蒿的ITS/ITS2条形码鉴定研究

    作者:刘戈宇;宁慧霞;阿吉艾克拜尔·艾萨

    目的:评价ITS/ITS2热点条形码序列对新疆4种绢蒿属植物及其近缘种银蒿的鉴别能力,为绢蒿属植物分类鉴定提供分子参考依据.方法:对15份绢蒿属及银蒿植物样本进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,采用CodonCode Aligner软件对序列峰图进行校对拼接,MEGA6.0分析序列碱基组成及变异,计算K2P遗传距离并构建聚类邻接树,预测ITS2序列二级结构,评估鉴别能力.结果:西北绢蒿、针裂叶绢蒿种内变异位点及信息位点数均小于银蒿.ITS序列种间、种内遗传变异均大于ITS2序列.ITS/ITS2序列邻接(NJ)树均聚为3支,绢蒿属、银蒿1、银蒿2.绢蒿属ITS2序列二级结构与银蒿有差异.结论:通过ITS/ITS2序列的种间K2P遗传距离、邻接树、ITS2序列二级结构分析,ITS、ITS2序列具很好的属鉴定效果,不同产地的针裂叶绢蒿被区分开.

  • 不同方法在手足口病原核酸检测中的效果分析

    作者:喻群英

    目的 探讨不同方法在手足口患者病原检测中的效果对比分析,为该病的病原检测提供依据.方法 标本为2010年1 月-10 月在我院所采集的手足口患者及幼儿园健康幼儿的粪便标本共164 份.采用RT-PCR 和荧光探针PCR 方法检测病人和正常人群粪便标本,并对结果进行对比分析.结果 Real-PCR 方法检出86 例阳性,阳性率为52.44%,RT-PCR 检出64份阳性,阳性率为39.02%.两组间的差异具有统计学意义(P<0.05).结论 荧光PCR 技术,能大大减少扩增产物污染的机会,与RT-PCR 技术相比,具有较高的准确率.

    关键词: 手足口 病原 PCR扩增
  • 中药材鹿鞭的分子鉴定研究

    作者:唐双焱;傅文;陈永久;王建云;蒋序;张亚平

    目的:建立中药材鹿鞭的分子分类学鉴定试剂盒.方法:根据对不同产地梅花鹿、马鹿、白唇鹿、水鹿线粒体DNA进行PCR扩增和序列测定,并与常见伪充药材来源动物线粒体DNA同位置序列比较,找到该4个鹿种的特征片段,经过实际检验,筛选出合适片段作为鹿的种属特异性PCR引物.结果:该引物与相关试剂组成试剂盒后,可用于中药材鹿鞭与常见伪充药材牛鞭、驴鞭等的鉴别.结论:用分子分类学方法鉴别中药材鹿鞭,具有科学、稳定、准确、简便等特点,值得推广.

  • 鸡内金的分子鉴定研究

    作者:曲萌;崔继春;董志恒;张丽华;王冰梅;张吉林;李才

    目的:建立一种简便、实用、准确的鸡内金药材DNA分子标记鉴定方法,从而为建立鸡内金真伪鉴别方法奠定基础.方法:从Genbank数据库下载家鸡及3种常见伪内金源动物的mtDNA细胞色素b基因序列,经同位置序列比较,遵循引物设计原则选择一个差异点较多的片段,设计PCR引物(引物1,2),并使用该引物分别扩增家鸡、3种伪内金源动物,4种非伪内金源动物的DNA.结果:所设计的引物只扩增家鸡DNA,而不扩增其他动物DNA.结论:该引物具有特异性,可用于鸡内金药材的鉴定.

  • 伪狂犬病病毒湖北株糖蛋白gD基因的克隆及序列测定

    作者:王家富;张楚瑜;丁建华;周荣;温淑娟;黄镇华

    伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是多种家畜和野生动物发生伪狂犬病的病原体.该疾病对畜牧业,特别是对养猪业的危害较为严重,两周龄内仔猪致死率可高达100%,成年猪可发生呼吸系统感染症,康复猪可潜伏感染,终生带毒,给世界各国养猪业造成巨大经济损失[1].阐明PRV与宿主的相互关系,研制安全有效的PRV基因工程疫苗成为目前研究的热点.

  • 马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

    作者:韩妮;张言坤;陈俊霞;苏帅;赵鹏;崔治中

    为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVTFC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对Ⅰ型MDV meq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-l株与其他疫苗株.结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带.同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性.因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗.

  • 解脲支原体感染与输卵管不孕的临床相关性研究

    作者:孙艳霞

    输卵管不孕是导致妇女不孕的主要原因之一,约占女性不孕的20~40%,并且输卵管不孕治疗比较棘手,是女性不孕症中较为复杂的问题之一[1].生殖道感染可引起输卵管的炎性改变或梗阻从而导致不孕,其中解脲支原体是重要的病原体之一.虽然解脲支原体感染的阳性意义及其在治疗方面的应用尚存争议,但对于不孕症、自然流产及胎停育患者,解脲支原体的作用仍是不容忽视的[2].本文检测输卵管不孕患者的解脲支原体感染情况,以探讨解脲支原体感染与输卵管不孕的临床相关性.

  • 应用DNA探针检测石蜡包埋组织中结核杆菌DNA的研究

    作者:黄莺;靳耀锋;苏宝山;王康敏

    结核病是严重危害人类健康的传染病,近年来发病呈上升趋势.由于外界理化环境的影响及菌体的变异,传统抗酸染色阳性率大为降低.

  • 石蜡包埋组织中提取结核杆菌-DNA的比较

    作者:黄莺;靳耀锋;王康敏;何长武

    20世纪80年代以来,结核病出现疫情回潮现象,卫生部今年公布的我国传染病发病率中,结核病居首位.早期诊断、早期治疗是控制传染源并使其有效治疗的关键.用PCR技术检测临床标本中的结核杆菌,为结核病的诊断提供了快速有效的方法.在实际工作中,我们发现由于某些干扰因素的存在,组织中结核杆菌-DNA的检测仍存在诸多问题[1],模板的有效提取直接影响扩增效率.从实际应用的角度出发,我们选取了4种方法进行结核杆菌-DNA提取的比较,现报道如下.

  • EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr)ompA基因原核表达载体重组构建

    作者:向雅倩;向会耀;谭玉梅

    目的 构建PThioHisA-ompA重组质粒. 方法 根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析.重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段.再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上. 结果 按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1 kb处有一清晰条带,与预期值相符. 结论 成功构建PThioHisA-ompA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础.

  • 144株结核分枝杆菌的耐药情况及耐药机制分析

    作者:伊学军;张爱玲;翟建新

    目的 分析结核分枝杆菌的耐药情况及耐药机制,为临床治疗用药提供指导. 方法 收集2015-2017年就诊结核病患者培养标本,分离结核分枝杆菌,剔除重复菌株.采用纸片扩散法进行药敏试验,根据2015年CLSI标准判定药敏结果.采用PCR扩增目的基因并进行测序,分析耐药基因分布及突变情况. 结果 本研究共分离结核分枝杆菌144株,2015年分离的39株菌株对利福平、对氨基水杨酸钠、氟喹诺酮的耐药率分别为17.95%、20.51%和25.64%,2016年分离的48株菌株耐药率分别为22.9%、12.50%和33.33%,2017年分离的57株菌株耐药率分别为36.84%、10.53%和40.35%.2015年分离株检出rpoB基因3株,thyA基因4株,gyrA基因5株,同时检出rpoB和gyrA基因2株,同时检出rpoB、thyA和gyrA基因1株;2016年分离株检出rpoB基因4株,thyA基因2株,gyrA基因8株,同时检出rpoB和gyrA基因3株,同时检出rpoB、thyA和gyrA基因2株;2017年分离株检出rpoB基因11株,thyA基因2株,gyrA基因12株,同时检出rpoB和gyrA基因5株,同时检出rpoB、thyA和gyrA基因2株.基因测序发现,rpoB基因突变位点主要包括456位C→T、451位C→A以及441位G→T,rpoB基因突变33株,突变率22.92%;thyA基因突变位点主要为19位和168位的C碱基缺失,thyA基因突变13株,突变率9.03%;gyrA基因突变位点主要包括94位A→C/G、90位C→T以及91位C→T,gyrA基因突变40株,突变率27.78%. 结论 结核分枝杆菌对临床常用抗结核药的耐药性与菌株基因突变情况直接相关,rpoB基因、gyrA基因以及thyA基因的突变情况是导致菌株对利福平、氟喹诺酮类药物以及对氨基水杨酸钠耐药的主要原因,但仍存在其他耐药机制.

  • 胸外科患者医院感染铜绿假单胞菌的耐药性变化及耐药机制分析

    作者:王俊钢;李聪聪;毛广显

    目的 分析胸外科患者医院感染铜绿假单胞菌的耐药性变化情况及耐药机制,为控制铜绿假单胞菌耐药性发展提供参考. 方法 分离自胸外科患者铜绿假单胞菌300株,其中2013年87株,2014年92株,2015年121株,采用K-B法测定菌株的耐药性,通过PCR检测菌株的耐药基因,扩增产物纯化后进行测序分析. 结果 2013年铜绿假单胞菌分离株对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、庆大霉素、阿米卡星、氨曲南、环丙沙星、亚胺培南耐药率分别为16.09%、26.44%、31.03%、36.78%、11.49%、41.38%、22.99%和6.90%,2014年分离株分别为31.52%、42.39%、32.61%、41.30%、17.39%、43.48%、38.04%和10.87%,2015年分离株分别为47.11%、51.24%、36.36%、53.72%、23.97%、42.98%、52.07%和14.05%.PCR扩增oprD、IMP、mexT、nfxB基因大小分别为1 340、412、638和827 bp.69株铜绿假单胞菌的IMP基因发生突变,突变率为23%,其基因突变发生在密码子的第640位,基因突变类型为A→G;相应氨基酸突变位点为第214位,氨基酸突变类型为Ser→Gly.51株铜绿假单胞菌的OprD基因发生缺失,缺失突变率为17%.141株铜绿假单胞菌的mexT基因发生突变,基因突变率为47%,其突变类型为26位氨基酸(Leu→ Val).84株铜绿假单胞菌的nfxB基因发生突变,基因突变率为28%,其突变类型为82位氨基酸(Arg→ Leu). 结论 胸外科患者医院感染铜绿假单胞菌对常用抗菌药物均不同程度耐药,且铜绿假单胞菌耐药基因的突变与细菌耐药性有一定关系.

  • 鲍曼不动杆菌外排泵基因与菌株多药耐药关系的研究

    作者:许磊;裘莉佩;王广芬;金雨虹

    目的 分析鲍曼不动杆菌耐药情况及外排泵基因分布情况,为临床感染治疗及耐药性控制提供指导. 方法 收集本院各科室送检的患者样本,对菌株进行分离培养,经全自动细菌鉴定仪鉴定出鲍曼不动杆菌110株,采用K-B法对菌株耐药性进行分析,用PCR扩增法对菌株外排泵基因分布情况进行检测. 结果 110株鲍曼不动杆菌中分离白ICU 41株,呼吸内科25株,神经外科15株,心脏外科12株,肿瘤科9株以及其他科室8株,分别占37.27%、22.73%、13.64%、10.91%、8.18%和7.27%.各科室鲍曼不动杆菌的分离率分别为40.20%、25.77%、23.81%、21.05%、16.36%、和7.77%.自痰液标本75株,导管标本12株,血液标本8株,尿液标本6株,引流液标本4株,其他标本5株,分别占68.18%、10.91%、7.27%、5.45%、3.64%和4.55%;不同标本的分离率分别为38.66%、15.58%、15.09%、13.04%、9.52%和7.69%.鲍曼不动杆菌对环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、利福平、四环素、红霉素、亚胺培南和美罗培南等常用抗菌药物的耐药率分别为50.91%、49.09%、63.64%、37.27%、77.27%、81.82%、20.91%和26.36%.adeA基因+adeB基因、adeB基因+adeC基因、adeA基因+adeB基因+adeC基因、mdfA基因+adeA基因+adeB基因+adeC基因、qacE△1基因+adeA基因+adeB基因+adeC基因、mdfA基因+qacE△1基因+adeA基因+adeB基因+adeC基因的检测率分别为1.82%、3.64%、44.55%、25.45%、10.91%和8.18%. 结论 鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物均产生了不同程度的耐药性,可能与菌株携带外排泵基因有关.

  • 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及研究

    作者:赵凤亭;程振云;徐莉娟;张傅山

    目的 分析医院患者送检标本耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离情况及其毒力基因检测情况,为预防医院感染的发生和控制病原菌感染扩散提供指导. 方法 收集住院患者(住院时间>48 h)送检标本,包括痰液、脓液、血液、分泌物、穿刺液、尿液以及导管标本等,分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,采用K-B法和PCR扩增法进行菌株的耐药性分析及毒力基因检测. 结果 共分离133株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,分别来自患者的痰液(占61.65%)、脓液(占12.03%)、血液(占12.03%)、分泌物(占6.02%)、穿刺液(占3.76%)、尿液(占3.01%)以及导管(占1.50%).K-B法药敏试验测定,133株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、四环素、环丙沙星、万古霉素的耐药率分别为100%、85.71%、73.68%、62.41%、51.13%、42.86%和0,PCR检测133株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的pvl、fnbA、clfA、sec、tst和sasX基因阳性率分别为88.72%、60.15%、42.11%、7.52%、4.51%和0. 结论 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌多数分离自患者的痰液标本,以呼吸道感染为主.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林100%耐药,可能与菌株自身生物膜的形成能力以及菌株毒力的降低关系密切;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的各种毒力因子呈现出不同的分布特征,可能与分离株的标本来源、遗传背景差异性等有关,而其耐药性变化与菌株毒力变化之间的相关性仍需进一步证实.

  • 淋病奈瑟菌TetM耐药基因的检测及质粒介导耐药性的分析

    作者:郭露;李文胜;丁世宁;贾文祥;雍刚

    目的建立淋病奈瑟菌TRNG株的PCR检测方法并对淋病奈瑟菌质粒介导的耐药性进行调查与分析。方法通过特异的引物设计,行PCR扩增、电泳,可以检测出淋病奈瑟菌的TRNG株。同时通过琼脂稀释法检测153株淋病奈瑟菌对青霉素及四环素的MIC值。结果 153株淋病奈瑟菌中,通过小抑菌浓度测定为TRNG株的83株菌,其PCR法结果均为阳性,其余为阴性。用质粒总量或菌悬液作为检测模板,其低检出率分别为0.1pg和100个菌细胞。淋病奈瑟菌质粒介导的耐药性调查显示:质粒介导的耐药率为87%,其中PPNG 71%,TRNG 54%,PPNG/TRNG 39%。PPNG/TRNG株已成为成都地区主要流行菌株。结论 TRNG株PCR检测方法具有很高的特异性和灵敏度。与传统方法相比,其简便、快速、准确,可以在一般实验室运用。成都地区质粒介导的耐药性保持高水平并呈上升趋势,应该引起有关部门的高度重视。

  • 耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β内酰胺酶表型及基因型检测

    作者:史映红;冯萍

    目的研究华西医院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌产金属酶的情况.方法采用亚胺培南和亚胺培南加EDTA纸片,筛选出金属酶表型阳性的菌株,再用PCR技术扩增耐药基因blaIMP和blaVIM.结果 49株耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌中,有30株菌(61.2%)金属酶表型阳性.PCR法检测到10株携带金属酶基因,6株(20%)携带blaIMP,4株(13.3%)携带blaVIM.结论华西医院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌要产金属酶.其基因型为IMP型和VIM型.

  • X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例

    作者:朱海燕;胡娅莉;朱瑞芳;王皖骏;朱湘玉;段红蕾;茹彤

    2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G>A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.

  • 中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究

    作者:刘向华;王义权;刘忠权;童宗中;周开亚

    目的运用分子标记技术鉴定药材蛇胆的真伪,以克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足。方法分别从药材蛇胆的胆衣和胆汁、原动物棕黑锦蛇的肌肉和胆汁中提取DNA,经PCR扩增得到约400 bp的12S rRNA基因片段,并对该基因片段进行测序研究。结果从少量药材蛇胆的胆衣和胆汁中可提得足够用于PCR扩增的DNA模板,扩增产物的测序结果表明同一动物的胆衣和胆汁、肌肉和胆汁的碱基序列完全一致。结论 DNA分子标记技术可用于中药材蛇胆和胆汁的鉴定,提示该技术也可用于其他动物分泌物类型药材的鉴别。目前市场上药材蛇胆来源较复杂,需加强质量监督和控制。

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