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肠道病毒EV71及CA16在不同细胞系中细胞病变作用的研究
目的研究CA16和EV71在4种细胞系中细胞病变作用的差异.方法随机选择滴度相似的EV71轻症、EV71重症和CA16轻症毒株各1株,分别感染RD、Vero、U251和SY5Y细胞,比较3株病毒在细胞病变的形态及程度、感染后的细胞存活率、病毒在细胞中的复制水平和病毒所致凋亡蛋白相关mRNA的表达水平等方面的差别.结果3株病毒的感染在同一细胞系中表现相似.镜下从形态学上无法对三株病毒加以区别;感染后病毒载量均表现为从高到低依次为Vero、RD、SY5Y细胞到U251细胞的顺序;病毒感染后细胞存活率的顺序与细胞内复制水平与相反,两者之间存在类似负相关的趋势.3株病毒的感染在3种细胞系中均有凋亡蛋白caspase-8、9和3相关mRNA的表达,提示可能3种细胞系中凋亡启动的途径相同.结论细胞水平的感染,提示这两种病毒感染所致临床表现的差异性并非单独由病毒所决定.
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雄黄纳米微粒在细胞水平上抑制呼吸道合胞病毒复制的初步研究
建立呼吸道合胞病毒A型(RSV-A型)感染Hep-2细胞模型,通过预防、治疗及直接灭活三种不同给药方式,观察中药雄黄对RSV-A型感染Hep-2细胞病变(CPE)的抑制作用.用高能球磨机研磨双蒸水水飞处理制备雄黄纳米微粒,应用砷钼蓝染色法测定雄黄纳米微粒浓度并在Nano Series粒度测定仪上测定其粒度.以MTT法计算药物的半数中毒剂量(TCs0).通过三种不同给药方式即预防给药、治疗给药及直接灭活给药方式进行体外实验,以利巴韦林为阳性对照药,观察雄黄纳米微粒对RSV-A型感染Hep-2细胞病变所起的作用,并对药物的量效关系进行分析.雄黄纳米微粒TC50值为0.649 μg/mL.预防、治疗及直接灭活给药方式均可减轻RSV-A感染Hep-2细胞的CPE程度,其抑制RSV-A型感染Hep-2细胞病变的半数有效浓度(IC50)分别为0.20 μg/mL、0.13μg/mL、0.16 μg/mL,治疗指数(TI)分别为3.18、4.99和4.11,雄黄纳米微粒对RSV-A型感染Hep-2细胞病变的抑制作用存在着明显的量效关系.雄黄纳米微粒按预防、治疗及直接灭活给药方式给药时,其中治疗给药方式更有利于减轻RSV-A感染Hep-2细胞引起的病变.
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云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定
本研究对前期从云南蚊虫获得的病毒分离物作进一步鉴定，以明确其分类地位。采用甲病毒通用引物进行RT－PCR检测，在5株病毒分离物扩增出目的基因片段。新分离株4株来自三带喙库蚊，1株来自中华按蚊。它们可使白蚊伊蚊细胞（C6／36）、猴肾细胞（Vero）及金黄地鼠肾细胞（BHK－21）发生规律性细胞病变。核苷酸序列分析显示5株病毒与盖塔病毒（ Getah virus， GETV）同源性高，与GETV中国云南YN0540株、河北株 HB0234、海南株 M1及南韩株、 LEIV MPR 株、鹭山病毒的同源性为96．4％～99．2％，5株病毒之间的同源性为98．4％～100％。系统进化分析结果显示，新分离株与上述GETV处于同一进化分支。以上结果证实5株病毒分离物为盖塔病毒。
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检测DENV-2活病毒含量RTCA标准曲线法的建立
目的 利用实时无标记细胞分析系统(real-time cellular analysis,RTCA)建立半数细胞指数时间(CIT50)与病毒滴度(TCID50)相关性的标准曲线,评估RTCA技术在监测2型登革病毒(DENV-2)感染BHK细胞后引发细胞病变效应(CPE)中的可行性和应用价值. 方法 检测不同培养条件下BHK细胞的CI值变化,筛选合适的初始细胞接种密度及血清浓度;应用RTCA分析已知不同TCID50滴度DENV-2感染BHK细胞的CIT50值,构建CIT50-TCID50标准曲线,计算回归方程;收集DENV-2感染C6/36细胞后第1～4 d的培养上清(D1,D2,D3,D4),利用RTCA法和TCID50法分别检测上清中DENV-2滴度,分析CIT50-TCID50标准曲线法的灵敏度和可行性. 结果 BHK细胞以初始接种密度为2×101个/孔,血清浓度为2％的培养条件为佳;不同滴度DENV-2感染后BHK细胞的生长曲线均左移,CIT50与TCID50间呈线性负相关,线性方程为y=-7.007x+75.546(R2 =0.9854);不同时间感染C6/36细胞培养上清中病毒含量(logTCID50/mL):RTCA标准曲线法为4.90±0.05(D2)、6.18±0.20(D3)、6.04±0.10(D4);传统TCID50法为0(D1)、6.25±0.49(D3)、5.87±0.35 (D4). 结论 利用RTCA技术建立的CIT50-TCID50标准曲线法,可用于已知DENV-2在BHK细胞的定量检测,结果较TCID50法更客观,且该法操作便捷且灵敏度高,为评估DENV-2感染性活病毒颗粒的毒力提供了新的技术手段.
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绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备
目的 人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)可致人上、下呼吸道感染.研究利用反向遗传学技术,以带绿色荧光蛋白(GFP)标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pClTE-L为基础,在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒(命名为rhMPV NL/1/00 GFP).方法 采用LipofectAMINE 2000将带GFP标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pcITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pcITE-L共转染BSR-T7细胞,3 d后取BSR-T7细胞上清液感染Vero-E6细胞,1-4 d后观察Veto-E6细胞出现明显细胞病变(CPE)和绿色荧光,持续观察至第10天.收集病毒上清用于病毒滴度检测.提取培养上清的病毒RNA并通过RT-PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒.结果 Vero-E6细胞接种1～4 d后观察到明显CPE和绿色荧光,随后CPE加重,荧光信号加强,持续至感染后10 d;第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于105.0～106.5TCID50/ml;RT-PCR检测出符合预期大小的910 bp(N)、450 bp(F)和980 bp(G)条带,经卜述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL/1/00原型病毒序列一致.rhMPV NL/1/00 GFP重组病毒在体外传代20代后,遗传信号和荧光信号均稳定.结论 采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒,为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础.
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重组轮状病毒NSP4蛋白对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用
目的 研究轮状病毒非结构蛋白4的86~175位氨基酸肽段(amino acid residues 86 to 175 of nonstructural protein 4,NSP486-175)对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用.方法 利用前期制备好的活性NSP486-175蛋白处理原代培养的大鼠神经元细胞,观察蛋白质处理后细胞的形态变化,检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;Fluo-3 AM标记细胞内游离的钙离子,蛋白质处理细胞后,用激光共聚焦显微镜检测神经元细胞内钙离子浓度变化.结果 正常生长的神经元细胞胞体丰满,呈不规则形或梭形,细胞突起数量较多并且较长,纯化的NSP486-175蛋白刺激后的大鼠神经元细胞出现明显的细胞病变效应,细胞密度稀疏,细胞胞体皱缩,细胞突起数量减少;蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增大;外源性添加NSP486-175能引起神经元细胞内荧光强度和分布改变.结论NSP486-175 对大鼠神经元细胞具有损伤作用,这可能与它导致细胞内钙库释放引起的钙离子浓度升高有关,为轮状病毒肠道外播散感染和致病提供了一定的理论依据.
关键词： 轮状病毒 NSP486-175 细胞病变效应 细胞内钙离子 -
细胞ERK信号通路对单纯疱疹病毒Ⅱ型增殖复制的影响
目的 以Raf-MEK-ERK通路关键激酶MEK1(MAPK/extracellular signal-regulated kinasekinase-1)为研究重点,利用MEK1-siRNA(small interfering RNA for MEK1)阻断宿主Raf-MEK-ERK通路,阐述该通路对病毒复制的作用.方法 用HSV-2感染预转染MEK1-siRNA的HEK 293细胞,应用观察细胞病变效应、病毒滴度以及病毒蛋白表达等研究方法,揭示细胞Raf-MEK-ERK通路对HSV-2增殖复制作用的影响.结果 MEK1-siRNA在特异性阻断MEK1表达的同时,能明显抑制HSV-2的复制.结论 体外实验表明,Raf-MEK-ERK通路在HSV-2增殖复制过程中具有十分重要的作用,MEK1-siRNA具有药物开发的潜能.
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巨细胞病毒感染、包涵体形成与生精细胞凋亡及不育症
本文就巨细胞病毒感染的病原学、流行病学、传播途径、发病机制、细胞病变效应和包涵体侵入细胞过程进行了介绍.对血管内皮细胞脂质体的形成,多发性骨髓瘤浆细胞内包涵体类型,精液中生精细胞内检出的6种包涵体类型和形态特征进行了描述.由病毒感染对精子运动的影响和生精细胞凋亡与男性不育,进行报道.
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关键词：
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痰热清抗呼吸道合胞病毒作用体外实验研究
目的 研究中草药注射液痰热清对呼吸道合胞病毒(RSV、Long株)的抑制作用.方法 以病毒唑为阳性对照药,采用细胞培养技术,观察不同药物浓度及不同给药方式下RSV攻击后各组Hep-2细胞的病变效应(CPE),在此基础上采用MTT比色法,测定各组细胞的病毒抑制率.以CPE法计算药物的半数中毒浓度TC50,分别以CPE法及MTT法计算药物的半数有效浓度Ec50及治疗指数TI,比较不同药物浓度及不同给药方式下热毒宁对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用效果.结果 痰热清注射液半数中毒浓度TC50为3.972g/L,预防给药方式、细胞外直接灭活及治疗给药方式均有抗RSV作用,其抗RSV的半数有效浓度(EC50)分别为0.428/1.160/1.189g/L,治疗指数TI分别是9.28、3.42和3.34,痰热清对RSV的抑制作用存在着明显的量效反应关系.结论 痰热清对RSV有直接灭活作用,对RSV侵入Hep-2细胞有阻断作用,对RSV在Hep-2细胞内增殖有抑制作用,相同浓度下,以预防作用更显著.
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临床常用中成药的体外抗流感病毒活性评价
本文旨在研究我国临床常用清热解毒中成药的体外抗病毒活性.通过应用已建立的流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制剂筛选模型,评价了33种临床常用中成药的NA抑制活性,应用已建立的流感病毒诱导的细胞病变效应模型,对具有NA抑制作用的部分中成药进行了体外抗病毒活性评价.结果表明,临床常用中成药液体制剂的NA抑制活性普遍较高,包括双黄连口服液、清开灵口服液、清热解毒口服液和热毒宁注射液,其中双黄连口服液在细胞水平对于病毒感染所致细胞病变效应(CPE)也具有较高抑制活性;中成药固体制剂中,双黄连注射粉针的NA抑制活性高,而复方鱼腥草片则显示较高的体外抗病毒活性.综合分析表明,大多数中成药具有一定的NA抑制活性,但只有部分药物具有明显的体外抗病毒活性,其活性结果对于中成药的活性物质基础研究和临床用药将具有指导意义.
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鸡血藤水提物抗柯萨奇病毒B3作用及机制
目的:探讨鸡血藤抗柯萨奇B3病毒(CVB3)的作用和机制.方法:不同浓度的鸡血藤水提物与适量CVB3感染的Vero E6细胞共同培养,采用甲基噻唑基四唑塞唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,计算鸡血藤水提物对CVB3,CVB5,埃可病毒9(Echo virus 9,EV9),EV29和脊髓灰质炎病毒(Polio virus1,PV Ⅰ)这5种肠道病毒的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI),并用RT-PCR检测鸡血藤水提物对CVB3侵染Vero E6细胞的RNA复制的影响.结果:鸡血藤水提物能有效抑制CVB3,CVB5,EV9,EV29和PV I这5种肠道病毒引发的细胞病变,IC50分别为60.8,47.1,17.1,65.5和29.1μg·mL-1,TI分别为4.1,5.3,14.6,3.8和8.6,对肠道病毒的抑制作用存在量效关系;鸡血藤不能阻止CVB3对Vero E6细胞的吸附作用,但可干扰CVB3侵染细胞后病毒核酸的复制.结论:鸡血藤能抑制CVB3引发的细胞病变,其机制可能是抑制侵染后病毒复制的初级阶段.
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H5N1禽流感病毒实验室检测方法灵敏性比较
目的 比对实验室常用的H5N1禽流感病毒检测方法灵敏性.方法 增殖H5N1病毒,蚀斑技术定量待检病毒,应用细胞接种、血凝实验、RT-PCR、Real-time RT-PCR等方法检测稀释的病毒悬液,比较检测的低滴度.结果 细胞接种、Real-time RT-PCR、RT-PCR及血凝实验能检测病毒的低滴度为10 PFU/mL、10 PFU/mL、10(3)PFU/mL及3.52 × 10(5)PFU/mL.结论 几种检测方法比较而言,细胞接种与Real-time RT-PCR枪测灵敏性高;血凝实验用时短,但灵敏性低,结果 需要进一步确认;RT -PCR用时较较短,检测灵敏性较高.
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板蓝根对柯萨奇病毒抑制作用的研究
目的探讨板蓝根对柯萨奇B4病毒(CB4V)抑制作用.方法采用组织细胞培养法,观察人宫颈癌传代细胞(HeLa细胞)病变效应及通过抑制病毒复制指数反应抗病毒的效果.结果板蓝根具有抑制HeLa细胞病变的作用;抑制CB4V复制指数为2.75.结论板蓝根在细胞水平具有明显的抗CB4V的作用.
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中药热毒清抑制人巨细胞病毒的体外实验研究
发育中的脑组织易受病毒感染的损害,嗜神经病毒可对人类胚胎脑组织造成损伤,这些病毒包括风疹病毒、巨细胞病毒(HCMV)、轮状病毒和疱疹病毒属中的其他病毒等,其中以HCMV为常见,但目前尚无对妊娠期HCMV活动性感染安全有效的治疗方法.本实验采用体外细胞培养技术在HF细胞内测定了不同浓度的热毒清对巨细胞病毒(HC-MV)的抑制作用.
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穿心莲水提取物体外抗柯萨奇病毒B3作用的研究
目的:研究穿心莲水提取物对Hela细胞的毒性与抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用及其机理.方法:通过观察药物毒性和病毒引起的细胞病变效应,用MTT法检测细胞活性,判断药物毒性及药物抗病毒效应.结果:穿心莲水提取物的半数毒性浓度(TC50)为23093.4μg/mL,半数抑制浓度(IC50)为23.2μg/mL,治疗指数(TI)为995.4.结论:穿心莲水提取物通过保护细胞,抑制病毒的增殖,直接杀灭病毒等途径发挥抗CVB3的作用.
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更昔洛韦体外抗人巨细胞病毒的实验研究
目的:探讨更昔洛韦体外抑制人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的作用方式.方法:根据病毒复制周期设计3种作用模式来观察更昔洛韦对HCMV的抑制作用:模式Ⅰ将病毒与细胞混合后,再加入药物;模式Ⅱ将药物与细胞混合后,再加入病毒;模式Ⅲ将药物与病毒混合后再加入细胞.通过观察细胞病变效应,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,以确定该药物治疗指数.结果:更昔洛韦对人胚成纤维细胞半数中毒浓度(TC50)为1 685.23 mg/L.在模式Ⅰ中,更昔洛韦对HCMV半数抑制浓度(IC50)为35.255 mg/L,治疗指数为47.8;在模式Ⅱ和Ⅲ中,更昔洛韦对HCMV无明显抑制作用.结论:更昔洛韦对HCMV感染细胞后显示出显著的抑制作用,且随药物浓度的增加其作用逐渐增强,存在明显的量效关系.同时,体外实验显示,更昔洛韦对人胚成纤维细胞感染HCMV无预防作用.
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热毒宁抗呼吸道合胞病毒(RSV,Long株)作用体外实验研究
目的:研究中草药热毒宁注射液对呼吸道合胞病毒(RSV,Long株)的抑制作用.方法:以病毒唑为阳性对照药,采用细胞培养技术,观察不同药物浓度及不同给药方式下RSV攻击后各组Hep-2细胞的病变效应(CPE),在此基础上采用MTT比色法,测定各组细胞的病毒抑制率.以CPE法计算药物的半数中毒浓度TC50,分别以CPE法及MTT法计算药物的半数有效浓度EC50及治疗指数TI,比较不同药物浓度及不同给药方式下热毒宁对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用效果.结果:热毒宁注射液半数中毒浓度TC50为3.972g/L.预防给药方式、细胞外直接灭活及治疗给药方式均有抗RSV作用,其抗RSV的半数有效浓度(EC50)分别为0.428、1.160、1.189 g/L,治疗指数TI分别为9.28、3.42和 3.34,热毒宁对RSV的抑制作用存在着明显的量效反应关系.结论:热毒宁对RSV有直接灭活作用,对RSV侵入Hep-2细胞有阻断作用,对RSV在Hep-2细胞内增殖有抑制作用,相同浓度下,以预防作用更显著.
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栀子苷对甲型H1N1流感病毒的抑制作用
为探讨栀子苷对甲型H1N1病毒的抑制效应,进行了相关体内外实验研究.体外实验中采用MTT法判定栀子苷对MDCK细胞的毒性作用.以帕拉米韦为阳性对照药,根据MTT比色值,观察栀子苷对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞的细胞病变效应(cytopathic effects,CPE),计算不同给药方式(预防给药、直接灭活及治疗给药)及不同药物剂量干预下,栀子苷对甲型H1N1流感病毒的抑制效率;体内实验以甲型H1N1流感病毒感染ICR小鼠,建立甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎模型,比较栀子苷不同剂量干预下,小鼠肺指数、肺组织病理学检查及小鼠存活率.实验结果显示,栀子苷的细胞毒性小,其TD50大于1040μmol/L;栀子苷在预防、直接灭活及治疗给药方式下,对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞抗病毒EC50分别为91.90、96.25和87.68 μmol/L,对CPE有明显抑制作用;栀子苷可显著降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺指数、减轻肺组织炎症损伤、降低小鼠死亡率、延长生存时间.实验结果表明,栀子苷在体外能有效抑制甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的CPE,在体内能有效保护甲型H1N1流感病毒对小鼠肺部的攻击作用,可能为流感病毒的防治提供一个新的选择.
关键词： 栀子苷 甲型H1N1流感病毒 细胞病变效应 抑制作用 -
五种中药制剂体外抗呼吸道病毒效果及细胞毒性的研究
目的 了解5种中药制剂体外抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒的效果,为抗病毒性感冒新药研发提供依据.方法 建立流感病毒感染MDCK细胞、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒感染Vero E6细胞的模型,以细胞病变效应(CPE)为观察指标,了解不同浓度5种中药制剂体外抗病毒效果及细胞毒性.实验中以病毒唑作为对照药.结果 1～5号中药制剂对MDCK细胞未出现细胞毒性的小稀释度分别为1:20、1:40、1:20、1:80和1:400,对Vero E6细胞则为1:40、1:80、1:20、1:20和1:100.1～5号中药制剂出现对流感病毒的IC50值分别为1:200、1:100、1:400、1:200和1:400,对柯萨奇病毒的IC50值分别为1:50、1:50、1:100、1:200和1:200,对呼吸道合胞病毒的IC50值分别为<1:25、<1:50、1:200、<1:25和1:100.结论 综合药效和细胞毒性实验结果 ,3号中药制剂可以作为抗病毒性感冒新药的首选制剂,其次为4号中药制剂.
