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人巨细胞病毒PP65_(322～561)片段的原核表达及功能鉴定
目的 构建人巨细胞病毒(HCMV)PP65_(322～561)蛋白片段的原核表达载体PQE30-PP65,并表达蛋白.方法 PCR扩增HCMV PP65第976～1686位核苷酸片段;构建重组表达质粒PQE30-PP65转化M15并表达蛋白;PCR、SDS-PAGE及Weatern blot鉴定重组载体及表达产物;ELISA检测目的蛋白的抗原性.结果构建了PQE30-PP65表达载体,在M15菌株中成功表达PP65_(322～561)蛋白,蛋白浓度达到2.2g/t.并与pp65单克隆抗体及HCMV LgG阳性血清反应良好.结论 成功构建PQE30-PP65表达载体,表达的目的蛋白具有良好的抗原性.
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重组金黄色葡萄球菌肠毒素A的表达及鉴定
目的 通过基因重组方式获得高纯度、高含量重组金黄色葡萄球菌肠毒素A(rSEA).方法 将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段插入pET28a载体中,测序并正确鉴定后,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白.重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化.结果 SDS-PAGE结果表明成功表达了分子量约为30 kD的重组蛋白,经Western blot和小鼠生物学鉴定,表达产物为重组金黄色葡萄球菌肠毒素A,并且具有较好的免疫原性,为制备抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单克隆抗体及建立相应的免疫学检测方法奠定了基础.结论 构建的rSEA表达载体稳定,可高效表达目的rSEA蛋白.
关键词： 重组金黄色葡萄球菌肠毒素A 葡萄球菌肠毒素 原核表达 -
豇豆胰蛋白酶抑制剂的非融合表达纯化
目的 探索一种能获得具豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)活性、免疫原性且氨基酸序列与天然蛋白一致的CpTI蛋白表达纯化方法,为评价转CpTI水稻的安全性提供重要材料.方法 将CpTI基因克隆到PET41EK表达载体中,构建该基因的非融合表达载体PET41EK-CpTI,将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,对诱导表达的时间、温度及IPTG浓度进行优化获得表达产物,对表达产物进行超滤和阴离子交换纯化从而获得纯化蛋白,对获得的纯化蛋白进行免疫原性、活性及N端测序鉴定等,并测定其浓度.结果 在大肠杆菌Rosetta(DE3)、20～25℃、130r/min、0.5mmol/L IPTG、过夜诱导表达条件下,经过30kDa超滤和DAEE FF阴离子交换纯化,可以获得可溶表达量高、具有CpTI免疫原性和活性的纯化蛋白,其纯度达到95％.结论 利用本研究建立的非融合表达方法可以得到在活性、免疫原性、分子量及氨基酸序列等方面与天然CpTI蛋白基本一致的CpTI蛋白,该法简单易行,能够满足大量生产表达的要求.
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大豆脱水应答元件结合蛋白(GmDREB1)的非融合原核表达及纯化
目的 大豆脱水应答元件结合蛋白(GmDREB1转录因子)基因是应用于转基因小麦中增强其耐旱、盐碱的基因,本研究拟探索获得与天然蛋白GmDREB1一致的蛋白表达纯化方法,以获得足量的蛋白纯品,为该外源蛋白的安全性评价奠定基础.方法 将GmDREB1基因克隆到原核表达载体pBV220中,构建重组表达载体pBV220-GmDREB1,转化E.coli DH5a进行诱导表达,通过优化GmDREB1基因密码子、改善诱导表达条件及选择合适的表达载体等实现目的蛋白的高效表达,对表达产物进行阳离子交换和分子筛等层析纯化,对获得的纯化蛋白进行序列、活性及免疫原性等测定.结果 含序列优化目的基因的重组载体pBV220-GmDREB1转化E.coliDH5a后,经42℃诱导表达2小时,获得了以可溶性为主的GmDREB1蛋白,经层析纯化获得了与天然目的蛋白一致的蛋白纯品.结论 利用本研究方法可得到在N端序列、活性及免疫原性等方面与天然GmDREB1蛋白一致的目的蛋白.
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人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化
目的 应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114～281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系.方法 采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定.将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达.融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物.结果 电泳显示RT-PCR产物约500 bp,与预期值一致.TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500 bp.阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致.构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20 kD的蛋白条带.结论 成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡配体 基因克隆 融合蛋白 原核表达 -
HIV-1 p15(Gag)基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
目的:构建HIV-1 p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体.方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性.纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性.结果:原核表达载体pET28 a(+)-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20 KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论:得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.
关键词： HIV-1 p15(Gag)基因 原核表达 免疫原性 多克隆抗体 -
黄热病毒特异性抗原片段的筛选与鉴定
目的 通过系统的生物信息学分析和实验验证,筛选黄热病毒的特异抗原片段,为免疫诊断试剂的研制奠定基础.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对黄热病毒蛋白进行分析,参考亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性及二级结构信息,对黄热病毒可能的共有及特异性抗原表位进行系统的预测分析,分析其在不同毒株中的保守性,并对预测得分值较高的抗原区域进行RT-PCR扩增,利用pMal-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应原性,检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,进一步验证其免疫学反应特异性及检测敏感性.结果 其中27段抗原片段获高效表达,经Western blot筛选及ELISA进一步验证,原核表达抗原片段YFV22表现良好特异抗,可检测低至1:12 800倍稀释的黄热病毒多克隆抗体,与所试其他参考病毒多克隆抗体无交叉反应.结论 经系统筛选、验证,获黄热病毒特异性抗原片段1段,为其免疫学诊断试剂的研制奠定了基础.
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丙型肝炎病毒聚合酶底物及pH值佳范围研究
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)聚合酶底物及pH值佳范围.方法 构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,测序及读码框架分析结果表明得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列,进一步利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化.结果 研究获得高效表达聚合酶蛋白的适条件,利用DNA-BAND培养96孔板,建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的模型.同时研究细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的HCV聚合酶作用底物及pH值的佳条件.结论 HCV聚合酶的高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶的底物及pH值对聚合酶的佳条件的确定为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.
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肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆、表达及活性鉴定
肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)是引起手足口病为常见肠道病毒,其中EV71是引起当前我国手足口病的病原优势株[1].目前临床对EV71感染以对症治疗为主,尚无有效的抗病毒药物,研制安全有效的疫苗和早期诊断试剂是预防控制手足口病疫情的经济有效地措施,为此进行以下相关研究.1.材料与方法:(1)材料:EV71/Henan/106/2009分离株(HQ998852.1)由本实验室从郑州市手足口病患儿粪便标本中分离并保种.手足口病患儿急性期血清和健康儿童血清标本采集于郑州市儿童医院.
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疏水性区域及稀有密码子对登革2型病毒E基因原核表达影响的分析
登革病毒E蛋白是病毒主要毒力蛋白,带有型特异及属特异抗原决定簇,既能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体,与登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的致病机制有关[1].有学者已经利用包括大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞等多种表达系统对其表达条件进行了探讨,由于受未知因素的影响,登革病毒E蛋白的原核重组表达一直不理想[2～4].本研究对登革病毒E蛋白不同区域的原核表达进行了较为系统的分析,探讨疏水性区域及稀有密码子登革病毒E蛋白表达的影响,并对部分区域进行了高效原核表达.广东省科技计划项目(20006836008005);全军医药卫生科研基金资助课题(06MA129)
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主要黄病毒E蛋白抗原表位分析与初步鉴定
目的 对主要黄病毒结构蛋白的抗原表位情况进行系统分析,鉴别共同及特异性抗原表位并对可能的特异性抗原表位进行原核表达.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎(乙脑)病毒及黄热病毒E蛋白的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析,预测可能的抗原表位.在此基础上,根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析6种病毒的共有及特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息,对预测的抗原表位进行比对,进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性.然后利用pET32及pMAL-c2x系统对可能的特异性抗原表位进行高效原核表达、Western blot验证其抗原性.结果 经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒1～4型、乙脑病毒及黄热病毒共有抗原表位15个,病毒特异性抗原表位47个.利用pET32及pMAL-c2x系统对6种病毒部分可能的特异性抗原表位进行了高效表达.Western blot结果显示登革病毒1型及2型表达抗原片段表现良好的抗原反应原性,并与试验中所用其他黄病毒及甲病毒多克隆抗体无明显的交叉反应.而所表达的登革病毒3型和4型、乙脑病毒及黄热病毒片段无抗原反应原性.结论 6条原核表达抗原片段经Western blot验证,获得登革病毒1型和2型特异性抗原片段.
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甲型副伤寒杆菌侵袭蛋白(spaO)基因原核表达及免疫性和保护作用研究
目的研究甲型副伤寒杆菌spaO基因重组表达产物rSpaO免疫性和保护作用,并了解甲型副伤寒杆菌临床菌株spaO基因携带和表达情况.方法扩增并克隆甲型副伤寒杆菌临床株JH01 spaO基因,构建原核表达系统;采用SDS-PAGE分析rSpaO表达情况,Ni-NTA亲和层析法收集rSpaO,采用Western blot鉴定其免疫反应性;采用PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株spaO基因携带和表达频率;观察rSpaO对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用.结果与报道的相关序列比较,克隆的spaO基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.45%～99.89%和99.01%～100%;rSpaO表达量为细菌总蛋白的75%左右;甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rSpaO;rSpaO免疫家兔可产生抗体;94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有spaO基因,91.4%(85/93)spaO+菌株表达SpaO.rSpaO灌喂或皮下注射免疫小鼠(500μg)受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率分别为58.3%和50.0%;若加入5μgrLTB,存活率分别上升88.3%和75.0%.结论甲型副伤寒杆菌临床菌株有较高的spaO基因携带率和表达率;rSpaO有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的候选抗原.
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甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素HA1氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立
甲型H1N1流行性感冒（简称流感）病毒是一种人类常见的流感病毒之一,2009年引起流感大流行的病毒并非一种全新的流感病毒[1]，陆一涵等[2]推测可能是北美地区的H1N4病毒发生了一定程度的变异（包括重组和重排）所致。基因组测序发现，该病毒包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段[3-4]，其中血凝素(HA)蛋白来源于猪谱系，一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病毒中[5]。HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原，与病毒吸附穿膜及宿主对病毒易感性有关[6-8],其变异率较高，常通过突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异主要体现在HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决定簇氨基酸的改变，因此甲型H1N1病毒HA1氨基端蛋白的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达此次甲型H1N1流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白，制备多抗血清，建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。
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北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达
目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白.方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的cDNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白.结果:得到北葶苈子GGPS cDNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系近;成功构建了pET-32a-LaGGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达.结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础.
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冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能
目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因IrCYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化.方法:根据转录组测序所得的IrCYP71基因片段,克隆出全长cDNA序列;构建pET28a(+)-IrCYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析.基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-IrCYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位.结果:克隆得到的IrCYP71基因全长cDNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在GenBank注册(登录号MG800628).经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 kDa左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85％.此蛋白亚细胞定位在细胞核.结论:对冬凌草IrCYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述.
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独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达
目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达.方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白.结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸.序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域.系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近.通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白.结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础.
关键词： 独行菜幼苗叶片 酶乙酰CoA酰基转移酶 基因克隆 序列分析 原核表达 -
滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析
目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.
关键词： 滇龙胆 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 基因克隆 原核表达 生物信息学分析 -
丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化
目的:在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上,为研究丹参SmJAZ蛋白的功能,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白,并对其表达条件进行优化.方法:利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行诱导表达.结果:对影响重组蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化,确定丹参SmJAZ1重组蛋白适表达条件.IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响；随诱导时间和诱导温度增加,SmJAZ蛋白的表达量增加；而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响.结论:丹参JAZ1蛋白在30℃温度条件下,重组菌生长2 h(A600 =0.9),加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG,诱导20 h后,表达条件合适.
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甘草鲨烯合酶基因多态性对其编码酶催化效率影响的研究
目的:分析甘草鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因多态性及其对编码酶催化效率的影响,为揭示优质甘草形成的分子机制奠定基础.方法:提取甘草总RNA; PCR扩增其SQS基因编码序列；测序后分析SQS序列的多态性；将具有明显差异的4个甘草SQS序列(SQS1C,SQS1F,SQS2A,SQS2B)连入表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21；IPTG诱导蛋白表达,纯化后用于体外酶促反应；GC-MS鉴定产物并比较相对含量.结果:甘草SQS1基因存在单核苷酸多态性(single nuclear polymorphisms,SNPs)、插入与缺失多态性(InDel)、选择性剪接(AS)多态性；SQS2基因只存在SNPs.氨基酸序列分析显示,SQS1非保守替换占53.94％,结构域中有2个位点突变；SQS2非保守替换占60％,结构域中有1个位点突变.在4种编码酶的体外酶促反应中,利用GC-MS均能检测到产物生成；SQS1F编码酶积累鲨烯的能力高于其他序列.结论:甘草SQS基因具有丰富的多态性,其编码酶催化效率差异显著,这可能是优质甘草形成的分子基础.
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人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及纯化
研究提取人参叶中的总RNA,采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因,构建pET-28 (a)-Cu/Zn-SOD原核表达载体.使用Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达.利用镍离子亲和层析进行纯化,并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活.经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00％.经IPTG诱导,目的蛋白的表达量约为44.42％,相对分子质量为16.30 kDa.纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U·mg-1.通过分子生物学方法,成功构建了人参pET-28(a)-Cu/Zn-SOD原核表达载体,为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础.
