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慢性氟中毒对大鼠骨组织Dlx5蛋白及其mRNA表达的影响
目的 观察慢性氟中毒对大鼠骨组织中转录因子Dlx5蛋白和mRNA表达水平的影响,探讨Dlx5在氟骨症发病机制中的可能作用.方法 本研究用36只SD大鼠按性别随机分成3组,对照组(饮自来水,含氟＜0.5 mg/L)、低氟组(饮含氟5.0 mg/L的自来水)、高氟组(饮含氟50mg/L的自来水),6个月后用氟离子选择电极法测定大鼠尿氟及骨氟含量,HE染色观察骨组织病理学改变,并采用原位杂交技术、免疫组织化学方法,对大鼠骨组织进行Dlx5蛋白及mRNA水平的定量分析.结果 HE染色显示染氟大鼠骨组织骨小梁增宽、骨皮质增厚等骨硬化表现；染氟大鼠骨组织Dlx5蛋白及mRNA表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(F低-蛋白=28.381,F高蛋白=343.515,F低-mRNA=27.767,F高-mRNA=353.987,P均＜0.05).结论 过量的氟可上调Dlx5蛋白及mRNA水平的表达,促进成骨细胞的增殖与分化,从而出现骨质硬化.
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氟对大鼠成骨细胞SPARC mRNA及其蛋白表达的影响
目的 观察慢性氟中毒时大鼠成骨细胞中成骨相关蛋白SPARC mRNA及其蛋白表达水平的影响,并探讨SPARC在氟骨症发病机制中的可能作用.方法 36只健康SD大鼠按体重、性别随机分3组,对照组自由饮用自来水(氟＜1 mg/L),低、高氟组分别饮用添加氟化钠5、50 mg/L的自来水.饲养8个月后,股动脉放血处死大鼠,用氟离子选择电极法测各组尿氟、骨氟含量.HE染色后光镜下观察股骨下段骨组织的病理学改变及形态计量学测量.免疫组织化学和原位杂交技术检测成骨细胞中SPARC蛋白及其mRNA的表达水平.结果 低氟组大鼠尿氟、骨氟含量[(6.09±0.56) mg/L、(12.65±3.07) μg/g]显著高于对照组[(1.36±0.51) mg/L、0.67±0.16) μg/g],差异有统计学意义(P均＜0.05),高氟组[(7.69±0.64) mg/L、(26.53±5.88) μg/g] 较低氟组升高,差异有统计学意义(P均＜0.05).染氟组大鼠股骨下段呈骨质硬化表现.低氟组大鼠SPARC蛋白及其mRNA表达水平(125.24±1.91、100.90±1.13)明显高于对照组(109.70±1.70、88.03±1.26),差异有统计学意义(P均＜0.05),高氟组(139.47±1.03、119.22±1.23)较低氟组升高,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 过量氟可通过上调大鼠成骨细胞中SPARC蛋白及其mRNA表达水平来调节成骨细胞的增殖、分化、成熟等过程,使骨形成增加,表现为骨硬化型.
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急性脊髓损伤与基因表达(一)
随着分子生物学特别是基因学技术的不断发展,许多实验室利用免疫组化法、原位杂交技术、PCR技术和基因芯片等先进的技术方法已经证实,在急性脊髓损伤后,有多个基因家族的近200个基因的表达和调控发生变化.这些变化参与了脊髓损伤后的一系列的病理、修复和再生过程,诸如脊髓对创伤的应激反应、循环障碍、创伤性炎症、神经元的变性坏死、凋亡、存活、再生、细胞内的信号传递等.本文复习了近12年发表的与急性脊髓损伤基因表达有关的研究报道,并做一简要的综述.
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原位杂交技术临床应用及实验室操作
原位杂交方法问世近40年,主要原理是依据碱基互补配对原则,设计特异性探针与待测样本中的互补核酸序列杂交,于原位检测目的基因的存在.该方法具有2个特点,一是基因水平的检测,即直接检测DNA或RNA;二是可以明确定位,在保存组织结构的同时,揭示组织细胞的异质性,细胞基因表达的异质性和细胞器中的区别定位,对感染因子的检测也有明显优势.除了高特异性和高灵敏性以外,原位杂交方法还可以进行组织定位.
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两种检测头颈部鳞状细胞癌HPV16/18感染状态方法的对比
目的 比较荧光定量PCR法(RT-PCR)和原位杂交法检测头颈部鳞状细胞癌中HPV(HPV) 16/18亚型感染的差异.方法 采用RT-PCR法和原位杂交法对78例头颈部鳞状细胞癌患者的肿瘤组织进行HPV感染状态的检测,评价两种方法的一致性.结果 RT-PCR法检测到62.8％的头颈部鳞癌组织中含有HPV16/18 DNA.原位杂交法检测到47.4％的肿瘤组织中有HPV16 DNA.用RT-PCR方法,唇、口腔、口咽及下咽的HPV16/18 DNA阳性率分别为33.3％、66.67％、70％和57.14％；用原位杂交方法,唇、口腔、口咽、下咽的HPV16 DNA阳性率分别为33.3％、43.8％、60.0％和57.1％.总体上,两种方法检测HPV16/18DNA具有较高一致性(Kappa=0.595,P＜0.001).结论 RT-PCR和原位杂交法检测HPV16/18 DNA结果的一致性较高.
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卡配因在大鼠脑缺血后细胞凋亡中的作用
脑缺血时,因可引起神经元碎裂和崩溃,以往一直认为卡配因引起的神经元死亡为坏死,但近来研究证明卡配因可导致神经元凋亡.卡配因能引起血影蛋白和染色质溶解,而脑缺血细胞凋亡时这些结构变化都有不同程度的发生.本实验旨在应用原位TUNEL、原位杂交技术,研究卡配因在大鼠脑缺血细胞凋亡中的作用.
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两种不同缓冲系统的多聚甲醛对鼠脑组化结果的影响
哺乳动物大脑皮质的发育长期以来都是发育生物学研究的焦点和热点.目前用于研究大脑发育的组织化学技术主要有原位杂交技术和免疫荧光染色,而这些技术均需要前期的标本制备,尤其是取材后的组织固定.组织固定的主要目的是尽可能保持组织内待检测物的原位性、完整性和免疫活性[1],所以组织固定的效果往往决定着组化实验终结果的成败.4％多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)因其优良的理化性质成为目前固定标本组织的常用固定剂之一[2-3],而关于其配制方法,尤其是用于溶解它的溶剂的选择目前还未有定论.本研究以此问题为出发点,比较不同溶剂的4％PFA对鼠脑组织的固定效果,探讨佳的组织固定方法.
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水通道蛋白4在大鼠眼球中的表达
目的从转录和翻译水平观察水通道蛋白4(AQP4),在正常Wistar大鼠眼球中的表达,为研究眼球中液体转运机制提供形态学基础.方法采用免疫组织化学SABC法和原位杂交技术.结果所测大鼠眼球呈较强的AQP4免疫反应阳性,角膜上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、睫状体非色素上皮细胞、晶状体上皮细胞、晶状体纤维细胞、视网膜的内颗粒层、外颗粒层和节细胞层的细胞均为阳性细胞,免疫反应阳性物质主要分布在细胞膜上,胞核呈阴性.原位杂交结果同免疫组织化学染色基本一致,在以上细胞胞浆中均可检测到较强的AQP4 mRNA阳性杂交信号,胞核呈阴性.结论AQP4可能在眼球中角膜和晶状体透明性的维持,房水的分泌和调节,视觉的激发和传递等功能活动中起着重要作用.
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EDTA缓冲液在原位杂交中的应用
蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.
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EBER-1与LCA双标记技术
原位杂交技术和免疫组化技术都可在组织细胞原位检测核酸分子或蛋白质分子.免疫组化是一种抗原抗体反应,检测的是蛋白质水平的表达;而原位杂交则是碱基配对,是基因或转录水平的检测.将这两种方法联合应用,可在同一细胞中显示某种mRNA或相应的蛋白质、多肽及其它抗原.我们用EBER-1和LCA在同一切片上进行双标记,获得了满意的结果.
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应用原位PCR、原位杂交技术对比检测尖锐湿疣组织中人乳头状瘤病毒DNA
为探讨原位PCR(ISPCR)的敏感性,对原位杂交(ISH)检测阴性或弱阳性的尖锐湿疣组织(CA)进行ISPCR检测,为其推广应用提供依据.
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亮视野原位杂交技术在乳腺癌HER2检测中的应用
随着乳腺癌分子发病机制的快速发展,乳腺癌的治疗策略发生了极大变化.个体化治疗,尤其是分子靶向治疗的快速发展使得组织分子靶点的检测成为关键环节.分子检测需求量的增加使得多种原位杂交技术应用于临床实验室.亮视野原位杂交在这方面有很多优势,检测乳腺癌HER2基因状态已成为亮视野原位杂交技术发展的主要推动力.
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NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达及其与淋巴结转移的关系
NDRG1基因(N-myc downstream regulated gene 1)是1997年由van Belzen等[1]用差异显示法从结肠癌细胞系HT-29中首先发现和分离的.Guan等[2]在8个结肠癌细胞系和10个结肠癌组织样本中研究了该基因与肿瘤转移的关系,提出该基因可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因.我们采用免疫组织化学、原位杂交技术,观察NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达特点,探讨其与结直肠癌转移的关系.
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微波快速原位杂交技术检测基因表达
核酸原位杂交技术目前已广泛应用于组织及细胞的基因表达定位和定量分析以及病毒基因组及表达的检测。常规的原位杂交技术主要强调组织细胞切片的前处理以提高其渗透性。常用的方法为蛋白酶酶解处理，但其作用的浓度和时间具有很大的范围，常难以准确把握。另外，杂交常需要16～24 h，检测周期长。近来，为了以稳定的、易控制的方法取代蛋白酶处理和缩短杂交的时间，我们应用微波处理技术，对以上两个步骤进行改良取得了很好的效果。
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高通量肿瘤组织-细胞系芯片技术平台的建立及应用
1998年Kononen等[1]首次介绍的组织芯片(tissue microarray)技术给广大病理学和相关学科领域的研究人员带来了极大方便,其中以在免疫组织化学和原位杂交技术中的应用为普遍.
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显色原位杂交技术在乳腺癌HER-2/neu原癌基因检测上的应用及意义
对于检测常规甲醛固定的乳腺癌石蜡组织切片中HER-2/neu原癌基因的核苷酸序列技术方法而言,荧光原位杂交法(FISH)一直是公认比较敏感和经典的检测方法[1-3].而显色原位杂交法(chromogenic in situ hybridization,CISH)作为一种核酸原位分子杂交技术方法,也可用于常规甲醛固定的乳腺癌石蜡组织切片中的HER-2/neu原癌基因的检测[4,5].
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乳腺癌个体化治疗相关标志物规范化检测体系的建立
乳腺癌的个体化治疗主要是在结合患者临床信息的基础上,再依据其肿瘤组织的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2的表达状态来制定相应的治疗方案,预测治疗效果和评估预后.因此,乳腺癌个体化治疗相关标志物-ER、PR和HER2的规范化检测体系的建立和应用是乳腺癌个体化治疗重要的基础.ER、PR和HER2检测的常用方法是免疫组织化学技术和原位杂交技术,其检测结果受到诸多因素的影响,包括标本的前期处理、固定,检测方法及实验室质量控制,检测结果的判读和病理报告的规范化等.由于在临床实践中还存在相当数量检测结果的不确定性或不可重复性,常导致乳腺癌临床治疗方面的困惑,临床医师难以准确制定治疗方案而可能造成误诊误治,甚至引起医疗纠纷.
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携耶尔森菌HPI大肠埃希菌的致泻性调查
HPI(high-pathogenicity island)为高致病力群耶尔森菌(包括鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌生物群1B)中发现的一种毒力岛,介导铁载体耶尔森杆菌素(siderophore yersiniabactin)的生物合成和摄取,为菌株致小鼠死亡所必需.近年来国内外学者在许多大肠埃希菌分离菌株中先后也发现了此HPI[1,2],然而,目前尚不明了大肠埃希菌中检出的HPI是否与菌株的致病性有关.我们对分离自杭州各类人群的大肠埃希菌菌株,应用菌落原位杂交技术和PCR技术检测HPI的保守核心区中irp2基因,以期了解携HPI的大肠埃希菌菌株的流行状况,探讨HPI与大肠埃希菌菌株致泻性的关系.
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用原位杂交证实检测非甲～非戊型肝炎患者肝组织中存在HGV RNA
应用原位杂交技术以地高辛素标记的HGV cDNA探针,对36例血清非甲～非戊型肝炎(HNA-E)患者肝组织中HGV RNA进行了检测,HGV RNA总检出率为30.6%(11/36),其中急性重型肝炎1例,亚急性重型肝炎3例,急性轻型肝炎3例,慢性肝炎4例.原位杂交阳性信号为兰紫色,细颗粒状,定位于肝细胞浆或/和核内.在急性和亚急性病毒性肝炎肝组织,阳性肝细胞多弥散分布,而于慢性肝炎多近汇管区呈片灶状.急性重型肝炎肝组织于残存的肝细胞中可见部分有阳性表达.肝组织免疫组化检出HGV NS5Ag阳性13例(36.1%),其中5例为HGAg单项阳性(急性重型肝炎1例,急性轻型肝炎3例及慢性肝炎1例).另8例同时呈HBsAg或/和HCV NS3Ag阳性.经统计,本组病例中原位杂交及免疫组化均阳性8例,两者均阴性16例,原位杂交阳性、免疫组化阴性3例,原位杂交阴性、免疫组化阳性5例,经配对计数资料的卡方检验,两种检出率差异无显著性(χ2=0.125,P>0.50).此外,病毒基因与抗原阳性表达的肝细胞其分布也较为一致,HGV RNA阳性信号不仅见于肝细胞胞浆内,也于肝细胞核和核周表达.
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组织芯片制作技术
组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissuemicroarray,TMA),是将数十至上千个小组织整齐地排放在一张载玻片上而制成的组织切片.1998年,Kononen等[1]首先制作了乳腺癌的组织微阵列,并应用荧光原位杂交、免疫组织化学和mRNA原位杂交技术研究了6种基因及其表达产物的表达状态.
