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乙型肝炎病毒表面大蛋白N-糖基化修饰对内质网应激的影响
目的 研究乙型肝炎病毒表面大蛋白(large surface protein of HBV,LHBs)N-糖基化修饰对内质网应激的影响.方法 将LHBs基因进行单点突变,检测野生型LHBs和突变型LHBs对内质网应激和EAED路径相关蛋白表达的影响.检测LHBs与多种泛素链的结合状态,确定LHBs的糖基化基序.结果 LHBs N-糖基化修饰与内质网应激有关.N15S、N123S、N177S位点突变的LHBs可以诱导L02细胞过表达EDEM.野生型LHBs和突变型LHBs均包含有P62衍生的UBA结合域.结论 LHBs N-糖基化修饰可以调节内质网应激.N320K可能是LHBs N-糖基化修饰的关键位点.
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050内质网应激与疾病
钙离子稳态的改变和未折叠或错误折叠蛋白质在内质网的蓄积可以引发内质网应激.内质网应激时间过长可诱发细胞凋亡.因此,内质网应激与很多因素所致疾病的发生、发展密切相关,常见有神经系统变性疾病、糖尿病和病毒感染性疾病以及一些化学毒物中毒引起的疾病.本文主要就近年来研究较为深入的未折叠蛋白质反应引发的内质网应激及其与细胞凋亡和疾病的关系作一简要介绍.
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Caspase-12在内质网应激中的激活途径及与疾病关系研究进展
随着内质网应激成为研究热点,作为其凋亡途径之一的Caspase-12激活也受到了更多的关注.Caspae-12是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员之一,目前仅在鼠中得到克隆物,而人体中的Caspase-12因为基因突变而丧失了调控凋亡的作用,但可能是其同源异构体Caspase-4发挥相同作用.目前发现有三种途径可以激活Caspase-12:IRE1途径、m-钙蛋白酶途径及Caspase-7途径,而这三种途径的发生都与内质网发生应激有关系,Caspase-12被激活后进入细胞液激活其他Caspase家族成员来完成凋亡途径.Caspase-12的激活导致了很多系统的疾病:淀粉样-β蛋白毒性导致的阿尔茨海默病、视网膜变性、呼吸系统感染等.提示可以把Caspase-12作为疾病防治的靶点,而对Caspase-12的了解将为Caspase-4的研究提供借鉴.
关键词： 内质网应激 Caspase-12激活 疾病 -
REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质磷酸化eIF2α表达的影响
目的 观察不同时间的快速眼动(REM)睡眠剥夺对大鼠额叶皮质磷酸化真核翻译起始因子(elF2α)蛋白表达的影响.方法 采用改良多平台睡眠剥夺法,将Sprague-Dawle大鼠分为6h、12h、24h和72h时间段进行REM期睡眠剥夺.采用免疫组织化学方法 和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术观察REM睡眠剥夺后大鼠额叶磷酸化eIF2α蛋白表达的分布特点和变化规律.结果 免疫组化观察到eIF2α(P)免疫反应阳性表达在睡眠剥夺6 h开始增多,12 h、24 h显著增多,72 h降低,阳性指数分别为80.733±4.094、121.288±3.453、106.197±6.611、67.890±4.173;Western b1ot实验发现,与对照组相比,REM睡眠剥夺早期大鼠额叶皮质激活了磷酸化的eIF2α,在12h(1.103±0.200)达到高峰,并持续到24h(1.095±0.157),睡眠剥夺72h(0.566±0.074)后逐渐下降.结论 短期REM睡眠剥夺能诱导大鼠额叶皮质磷酸化eIF2α蛋白表达,使蛋白合成抑制.
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衣霉素激活的心肌细胞氯通道及其电生理学特性
目的 探讨内质网应激(ERS)的激活剂衣霉素(Tm)能否激活心肌细胞的氯通道,并观察其电生理学特性.方法 原代培养新生SD大鼠心肌细胞,用等渗外液灌流作为对照,然后改变灌流液为低渗或者舍有衣霉素的等渗外液,同时通过膜片钳全细胞模式记录电流.结果 (1)在等渗外液下,仅记录到低幅度的基础电流.与等渗外液相比,低渗外液灌流细胞时电流的密度在+40、+60、+80及+100mv时明显增加(P＜0.05),并且电生理学特性类似于容积敏感氯通道(VSOR)的电流,包括:外向整流、正电压依赖性失活,以及对氯离子通道阻断剂4,4’-异二硫氮氏-2,2’-二磺酸(DIDS)敏感.(2)与等渗外液对比,含有衣霉素(2.5μg/ml)的等渗外液灌流同样可以记录到电流密度的显著增加,电生理学特性类似于低渗外液诱导的VSOR氯通道电流.结论 衣霉素可以诱发乳鼠心肌细胞的氯通道电流,并且符合VSOR的电生理学特性.
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内质网应激诱导的细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤
缺血再灌注损伤是心血管疾病中常见的病理生理过程,在心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用.缺血再灌注损伤确切的机制还不完全清楚,实验证实细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程中发挥着重要的作用[1].
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内质网应激联合线粒体在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中作用的体外实验研究
目的:通过体外实验探讨内质网应激联合线粒体在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用.方法:采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建高血糖大鼠模型,进而通过体外海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖培养建立脑缺血再灌注模型.实验分为正常对照组(NC)、正常血糖缺氧缺糖/复氧复糖组(N-OGD/R)和高血糖缺氧缺糖/复氧复糖组(H-OGD/R).采用免疫组化法检测脑片中胱天蛋白酶(Caspase)-3、细胞色素C(Cyt C)蛋白表达,ELISA法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,以及荧光定量RT-PCR技术检测葡萄糖调节蛋白(GRP)78mRNA表达量.结果:与N-OGD/R组相比,H-OGD/R组Caspase-3和Cyt C的平均光密度(OD)明显升高(Caspase-3:0.348±0.004,F13.398,P﹤0.01;Cyt C:0.328±0.005,F15.444,P﹤0.01),LDH含量明显增加(6.323±0.499,F45.846,P﹤0.01),GRP78mRNA的表达量明显升高(2.350±0.522,F13.347,P﹤0.01).结论:高血糖可加重大鼠脑缺血再灌注损伤,内质网应激(ERS)联合线粒体途径可能协同参与了大鼠脑缺血再灌注损伤过程.
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硫化氢对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中内质网应激PEEK,Caspase-12分子表达及凋亡调控机制的研究
目的:研究硫化氢对大鼠肝缺血再灌注后PEEK,Caspass-12的影响,从内质应激角度探讨PEEK,Caspass-12表达及凋亡的机制.方法 健康雄性SD大鼠36只,雌雄不拘,体重250～300 g,采用随机数字表法,将其随机分为假手术组、缺血再灌注组(IR组)和硫化氢组,每组12只.假手术组仅暴露肝门,不夹闭动、静脉;缺血再灌注组采用夹闭左、中叶肝蒂、门静脉和肝动脉支1h恢复灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注模型;硫化氢组于再灌注前5分钟腹腔注射28 μmol/kg硫化氢钠.于再灌注6小时抽取下腔静脉血样并取肝组织,应用免疫组化方法检测三组内质网应激分子PEEK,Caspass-12的改变.结果 在再灌注6h后PEEK,caspases-12,蛋白的表达增高,出现大量凋亡细胞.结论 内质网应激诱导的细胞凋亡可能参与肝IRI,硫化氢可减轻大鼠肝缺血再灌注损伤.
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谷维素可用于治疗嗜食脂肪导致的肥胖
谷维素概述
谷维素一般从食品加工业副产品米糠中提取，主要调节植物神经紊乱，用于治疗自主神经功能失调、原发性痛经、经前期紧张症、更年期综合征等。近期，来自日本德岛大学生物医学科学研究所心脏与糖尿病医学部门的一项新研究发现，谷维素可以产生一种新型的促胰岛素全谷物衍生γ谷维素机制。即谷维素具有一种意想不到的效果，专治偏爱脂肪食物的肥胖。谷维素来源于糙米或麦麸皮，由主要成分由阿魏酸酯和植物甾醇或三萜醇混合而成，具有一定的生理活性，从糙米中提取的谷维素通过下调下丘脑内质网应激降低小鼠对食物脂肪的偏爱。 -
β淀粉样蛋白对大鼠海马神经细胞内质网应激的影响及机制研究
目的 研究β淀粉样蛋白(Aβ25-35)对SD大鼠海马神经细胞内质网应激(ERS)的影响及其机制研究.方法 60只雄性SD大鼠随机分为6组,分别为高剂量组(7.5μg/μl)、中剂量组(5μg/μl)、低剂量组(2.5μg/μl)、生理盐水组、假手术组和空白对照组,每组10只.通过立体定位仪向大鼠两侧海马位置分别注射Aβ25-35 2μl制造AD模型,在光学显微镜和电子显微镜下观察内质网形态,Western blot、RT-PCR检测GRP78、ATF-6、IRE-1和PERK的表达变化.结果 Aβ25-35可损害海马神经细胞,表现为细胞排列紊乱疏松、细胞肿大有空泡、少数细胞出现核偏位和核固缩.Aβ25-35可以损害内质网形态,导致海马细胞内质网肿胀肥大,扩张明显,内质网管膜破裂等.与空白对照组比较,GRP78、ATF-6、IRE-1和PERK的mRNA及蛋白的表达水平均增高,除低剂量组PERK mRNA之外其他各剂量组上述指标与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Aβ25-35可导致大鼠海马神经产生ERS,启动UPR的凋亡信号通路.
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内质网通路在氯胺酮致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用初探
目的 研究内质网通路在氯胺酮(Ketamine)致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用.方法 采用0.0、12.5、25.0、50.0和100.0 μg/ml的氯胺酮处理SH-SY5Y细胞48 h时,采用MTT比色法检测细胞的生长率;荧光探针检测细胞内活性氧;流式细胞仪检测细胞凋亡和胞内钙离子浓度;Western blot检测CHOP蛋白的表达量.结果 与空白对照组相比,所有氯胺酮处理组细胞活力均显著降低,活性氧显著升高(P ＜0.05或P＜0.01);胞内钙离子浓度和CHOP蛋白表达量,除12.5 μg/ml氯胺酮处理组外均显著升高(P＜0.05或P＜0.01).与未处理对照组相比,细胞凋亡率25.0、50.0和100.0 μg/ml氯胺酮处理组显著升高(P＜0.01).结论 一定浓度氯胺酮可通过内质网通路引起人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的发生.
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顺铂诱导Hela细胞内质网应激途径凋亡的研究
目的 观察顺铂对Hela细胞内质网应激和凋亡的影响及其机制.方法 体外培养宫颈癌Hela细胞,通过MTT法测得顺铂适应激剂量为4.5μmol/L,实验分为对照组、顺铂4h组、顺铂8h组、顺铂12 h组,以观察顺铂作用Hela细胞后,其内质网应激及相关凋亡的动态变化.Western Blot法检测各组细胞内质网应激、凋亡相关蛋白表达.流式细胞术检测凋亡.结果 与对照组相比,内质网应激相关蛋白GRP78,内质网应激信号凋亡调节蛋白IRE1α、p-JNK表达水平明显升高,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增加;内质网应激诱导的凋亡蛋白Caspase-4和凋亡执行分子Caspase-3的裂解形式蛋白表达水平明显升高.流式细胞术检测结果 显示,顺铂作用后与对照组相比,细胞凋亡率明显增加.结论 顺铂可能诱导Hela细胞发生内质网应激,从而促进细胞凋亡的发生.
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内质网应激及其介导的凋亡在锰致神经毒性中的作用
目的 探讨内质网应激(ERS)及其介导的细胞凋亡在锰引起的神经毒性中的作用.方法 以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为细胞模型,通过MTT比色法检测MnCl2对细胞存活的影响,流式细胞技术(FCM)检测MnCl2对细胞凋亡的影响,Western blot检测MnCl2作用后,细胞ERS分子伴侣BiP、Sigma-1受体(Sig-1R)、CHOP及凋亡相关蛋白Caspase-4表达的变化.结果 MnCl2可呈时间、剂量依赖性地降低细胞存活率,并诱导SH-SY5Y细胞凋亡；MnCl2上调ERS分子伴侣Bip、Sig-1R、CHOP及Caspase-4的表达.结论 MnCl2可诱导SH-SY5Y细胞发生ERS,早期的ERS对细胞具有保护性效应,持续的ERS通过上调CHOP和Cappase 12的表达介导细胞凋亡,这可能是锰神经毒性机制之一.
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MnCl2引起SH-SY5Y细胞内质网应激及Sigma-1受体的保护作用
目的 探讨内质网应激(ERS)及其介导的细胞凋亡在锰引起的神经毒性中的作用,进一步探讨Sigma-1R在锰致神经系统损害中的作用.方法 以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为细胞模型,通过MTT比色法检测0.5、1、2、4、8和24 h处MnCl2对细胞存活的影响,流式细胞技术(FCM)检测上述时间段MnCl2对细胞凋亡的影响,Westernblot检测MnCl2作用上述时间后,细胞ERS分子伴侣GRP78、Sigma-1受体(Sigma-1R)、CHOP及凋亡相关蛋白Caspase-4表达的变化,Sigma-1R拮抗剂BD1047抑制其活性4和24 h后,检测细胞凋亡的情况.结果 MnCl2可呈时间、剂量依赖性地降低细胞存活率,并诱导SH-SY5Y细胞凋亡；MnCl2上调ERS分子伴侣GRP78、Sigma-1R、CHOP及Caspase-4的表达；加入拮抗剂BD1047后,在4和24 h细胞存活率明显下降.结论 MnCl2可诱导SH-SY5Y细胞发生ERS,ERS通过上调Sigma-1R的表达,增加细胞的存活率,这可能是预防锰神经毒性的机制之一.
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胞浆内Ca2+浓度的变化在顺铂诱导的肝癌HepG2细胞凋亡中的作用
目的 探讨胞浆内的Ca2+在顺铂诱导的肝癌HepG2细胞凋亡过程中的作用及其可能机制.方法 体外培养人肝癌HepG2细胞,分组并按实验目的加药,检测胞浆内Ca2+浓度的变化和Grp78蛋白的表达;MTT法检测细胞的活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 顺铂诱导了肝癌HepG2细胞内胞浆Ca2表达增加,促进细胞凋亡,同时也上调了Grp78蛋白的表达.与顺铂组相比,顺铂联合BAPTA/AM或2-APB降低了顺铂诱导的胞浆Ca2+浓度,减弱了顺铂对细胞的增殖抑制作用和Grp78蛋白的表达.结论 顺铂诱导HepG2细胞发生内质网应激,导致Ca2+从内质网释放,使胞浆内Ca2+上调,并进一步诱导内质网应激介导的凋亡.
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芹菜素对丙烯腈致大鼠肝内质网应激的影响
目的 探讨芹菜素(apigenin,AP)对丙烯腈(acrylonitrile,ACN)致大鼠肝内质网应激(ERS)信号通路的影响.方法 40只雄性SD大鼠随机分为对照组(玉米油)、ACN组(50 mg/kg·bw ACN)、低AP干预组(234 mg/kg·bw AP+ 50 mg/kg·bw ACN)和高AP干预组(468 mg/kg·bw AP+ 50 mg/kg·bw ACN),灌胃量均为5 ml/kg·bw,1次/d,每周6d,共13周.末次染毒结束后,次日处死大鼠.分光光度法测定肝组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力;RT-PCR检测ERS相关基因GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA表达水平;Westem blot检测ERS相关蛋白GRP78、CHOP和Caspase-12表达水平.结果 ACN组大鼠肝SOD活力、GSH-Px活力和GSH含量均低于对照组,MDA含量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);低、高AP干预组大鼠肝SOD活力、GSH含量均高于ACN组,GSH-Px活力低于ACN组,差异有统计学意义(P＜0.05).ACN组大鼠肝组织GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P＜0.05).低AP干预组大鼠肝组织GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA相对表达水平均低于ACN组(P＜0.05),差异有统计学意义.高AP干预组大鼠肝组织GRP78和CHOP mRNA相对表达水平均低于ACN组(P＜0.05),GRP78、Caspase-12蛋白表达水平均低于ACN组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ACN可致大鼠肝氧化损伤,激活ERS信号通路,AP可减轻ACN引起的ERS.
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胞浆内的Ca2+浓度变化在五味子乙素诱导HepG2细胞凋亡过程中的作用
目的 探讨五味子乙素在诱导HepG2细胞凋亡过程中Ca2浓度变化的作用和可能机制.方法 体外培养人肝癌HepG2细胞,分为空白对照组、2-APB(2-Aminoethyl diphenylborinate)组、五味子乙素组和联合用药组(五味子乙索与2-APB合加),加药48和72 h后,MTT检测细胞存活率,激光共聚焦显微镜、免疫印迹法检测内质网相关蛋白Grp78、Cleaved caspase-4和CHOP蛋白含量,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率.结果 与单加五味子乙素组相比,联合用药组的细胞生存率明显升高(P＜0.05),Ca2浓度、Grp78、Cleaved caspase-4、CHOP蛋白的含量明显降低(P＜0.05).结论 五味子乙素能诱导人肝癌HepG2细胞内质网应激,导致细胞内Ca2浓度显著升高,并进一步诱导细胞凋亡.
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肿瘤坏死因子α诱导ATF6、IRE1介导的未折叠蛋白反应
目的 研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠纤维母细胞(L929)中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、X盒结合蛋白1(X box binding protein 1,XBP-1)表达的影响,探讨TNFα信号传导通路与内质网应激的相关性.方法 体外培养L929细胞,分别用TNFα、Tunlcamycin作用0、2、4、6、8和10 h,以Western Blot、Northern Blot检测内质网应激的标志分子:GRP78蛋白的表达,以及非折叠蛋白反应中的关键分子:XBP-1蛋白及mRNA水平表达;用RT-PCR结合Pst1酶切法检测XBP-1 mRNA的剪接作用.结果 TNFα作用于L929细胞即可以引起GRP78蛋白、XBP-1蛋白及XBP-1mBNA表达的升高,又可以诱导XBP-1mRNA的剪接作用;且这些分子表达的升高及mRNA的剪接作用均发生在TNFα作用的早期(开始于TNFα作用的2 h,4 h达到高峰,6 h后逐渐减弱).结论 TNFα作用于L929细胞可以诱导内质网应激,由此引起的活化转录因子6(activating transcription factor6,ATF6)、ER转膜蛋白激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IBE1)介导的未折叠蛋白反应对细胞具有促生存作用.
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肿瘤坏死因子α诱导PERK-eIF2α介导的未折叠蛋白反应
目的 研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠纤维母细胞(L929)中elF2α磷酸化及ATF4、CHOP表达的影响,探讨TNFα信号传导通路与内质网应激的相关性.方法 用TNFα作用于L929细胞0、2、4、6、8和10 h.以WesternBlot检测elF2α磷酸化和CHOP的表达;以Northern Blot检测ATF4mRNA的表达.结果 TNFα对L929细胞的杀伤作用呈时间依赖性,TNFα作用于L929细胞可以引起eIF2α磷酸化的增高、CHOP蛋白及ATF4mRNA表达的升高;且CHOP、ATF4表达的升高均发生在TNFα作用的早期(4 h达到高峰).结论 TNFα作用于L929细胞引起的内质网应激,可以通过激活未折叠蛋白反应的PERK-elF2α途经来缓解TNFα对肿瘤细胞的杀伤作用.
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内质网应激与肝脏脂质代谢关系的研究进展
内质网是细胞内负责蛋白合成、折叠、修饰和转运的细胞器,在钙离子稳态和调节固醇类、脂质和糖类的生物合成中发挥重要作用[1].在内质网中有大量的蛋白被合成,但并不是所有的这些蛋白都可被正确的折叠和处理加工,在正常的生理状态时,非折叠或未折叠蛋白可通过活化未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)直接被降解.UPR活化后可清除未折叠蛋白并恢复细胞内稳态,或者可活化一系列的细胞内信号而导致细胞死亡[2].UPR在肝脏蛋白、胆固醇、胆汁酸和磷脂的合成中发挥作用,并且UPR与各种肝脏疾病如酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)、非酒精性脂性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)、药物性肝病(Drug Induced Liver Disease,DILD)和病毒性肝炎密切相关[3].
