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  • 我国首例输入性裂谷热病例病毒全基因组测序分析

    作者:潘阳;崔淑娟;陈丽娟;吕燕宁;卢桂兰;孙玉兰;李洁;窦相峰;李锡太;黎新宇;王全意

    目的 对我国首例输入性裂谷热病例病毒进行全基因组测定,分析其进化来源及潜在变异.方法 提取样本核酸,非特异性反转录扩增病毒基因组RNA,使用Ion Torrent二代测序仪进行病毒全基因组测定.对获得的基因组数据进行序列拼接、比对、进化树构建和关键位点分析.结果 通过测定获得了病毒全基因组11 979nt,该测定病毒属E基因分支,序列与先前南非分离株Kakamas相似度高(>98%).病毒Gn蛋白C端信号肽区存在1个氨基酸突变.结论 本研究分析测定的裂谷热病毒全基因组与目前非洲流行株高度相似,病毒基因特征未出现明显变异.

  • 采用二代测序对脊髓性肌萎缩家系行胚胎植入前遗传学诊断

    作者:倪梦霞;王玮;郑爱燕;丁洁;邢丽贤;刘敏娟;毛君;蒲艳;邹琴燕;孟庆霞;李红;偶健;张癸荣

    目的 探讨二代测序技术对脊髓性肌萎缩症(SMA)家系行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的应用价值和优势.方法 选取1对于苏州市立医院生殖与遗传中心就诊的SMA基因携带者夫妇,经家系调查后,抽取家系成员外周血,采用Real-time PCR法进行分析,明确基因突变位点.针对突变位点涉及基因及基因的上下游区域内选择高密度紧密连锁的单核苷酸多态(SNP)作为遗传标记.二代测序(NGS)后,选择若干有效位点进行单体型分析.后使用单体型连锁分析技术进行单基因PGD. 结果 此对夫妇的SMN1基因exon7均为单拷贝,而先证者为SMN1基因exon7纯合缺失.通过单体型连锁分析之后进行单基因病PGD周期,形成4枚囊胚,NGS PGD检测结果为未携带突变的整倍体囊胚、单拷贝携带的整倍体囊胚、单拷贝携带但为非整倍体囊胚和致病的整倍体囊胚各1枚.将未携带突变的整倍体囊胚行冻融胚胎移植后获得临床妊娠,产前诊断结果显示未见异常,足月剖宫产分娩一正常男婴,体重3 150 g,健康状况良好. 结论 采用NGS对SMA家系行PGD可以阻断此单基因病在该家系中的再发风险,还可以避免选择非整倍体胚胎而导致的流产问题.

  • 胚胎植入前遗传学筛查技术的应用进展

    作者:岳佳;李永刚

    胚胎植入前遗产学筛查通过对胚胎染色体数目异常的筛查来改善体外受精-胚胎移植的妊娠结局,尽管对筛查技术的准确率以及对妊娠结局的影响还存在争议,但其已被广泛地应用于人类辅助生殖技术中.随着细胞遗传学和分子遗传学的不断发展,各种新的遗传分析方法应用于胚胎植入前的遗传学筛查,如微阵列比较基因组杂交、单核苷酸多态微阵列技术、第二代测序技术以及延迟监测技术等.这些新技术的应用在理论上都能提高种植率和妊娠率,但在实际的临床实践中依然存在不同的局限性.本文综述胚胎植入前遗传学筛查中各项技术的应用进展及该领域的发展方向.

  • 二代测序技术对活动性结核病患者的诊断价值

    作者:周晛;艾静文;崔鹏;阮巧玲;沈瑶杰;王森;李永军;张文宏

    目的 评价二代测序技术在活动性结核病患者中的诊断价值.方法 前瞻性纳入2017年3月1日至2017年9月1日来华山医院就诊的临床怀疑活动性结核病的患者34例,在华山医院进行二代测序,并跟踪随访临床诊疗结局.送检标本(支气管灌洗液4例,脑脊液18例,胸腔积液4例,脓液3例,腹腔积液、肝组织各2例,关节积液1例)均在BGISEQ-100平台上行二代测序,测序所得病原序列和病原数据库进行比对得到终结果.二代测序结果以检测到结核分枝杆菌复合群唯一匹配序列为阳性,未检测到唯一匹配序列为阴性.以符合各类标本结核分枝杆菌培养阳性、病理诊断为结核感染、Xpert MTB/RIF检测阳性及结核分枝杆菌核酸检测阳性等4项中至少1项即为确诊活动性结核病患者;临床可疑活动性结核病且抗结核药物治疗有效为临床诊断患者;有其他病原学依据或临床排除活动性结核病者为非结核感染.分析二代测序在活动性结核病诊断中的敏感度、特异度.结果 确诊为活动性结核病患者9例,其中Xpert MTB/RIF检测阳性6例,病理诊断为结核感染4例,培养阳性3例,结核核酸PCR检测阳性1例;临床诊断为活动性结核病患者10例,非结核感染患者15例.在确诊及临床诊断患者中,二代测序技术检测到结核分枝杆菌复合群序列11例,敏感度为57.9%(11/19),特异度为100.0%(15/15).在确诊患者中,二代测序技术的敏感度为66.7%(6/9);在同步进行Xpert MTB/RIF检测与二代测序的31例标本中,以临床诊断为金标准,两者的特异度均为100.0%(15/15),敏感度分别为37.5%(6/16)与50.0%(8/16),两者比较差异无统计学意义(McNemar test,P=0.727).结论 二代测序技术能够较为快速地检测多类标本中的结核分枝杆菌复合群,且其敏感度及特异度与Xpert MTB/RIF相当,可以作为确诊试验用于活动性结核病的早期辅助诊断.

  • 孕妇血浆中胎儿游离DNA片段浓度和长度均值的计算方法研究

    作者:路建波;高华方;曹宗富;李乾;蔡瑞琨;闫有圣;马旭

    目的:建立计算孕妇外周血中胎儿游离DNA片段(cffDNA)浓度和长度均值的新的数学模型.方法:根据孕妇外周血中母亲和胎儿的DNA片段的长度分布不同的现象,利用K-means算法和EM算法开发新的算法.用提出的新方法分析孕妇外周血样本的DNA片段长度分布,cffDNA浓度和片段长度均值.结果:①三份样本中来源于母亲的DNA片段长度均值,分别为167bp,166bp和165bp;cffDNA的长度均值为160bp,163bp和158bp;②孕妇血浆中cffDNA的浓度分别为10.4%,5.5%,17.4%.此结果与基于Y染色体的百分含量的方法计算所得的结果相近.结论:用本课题组提出的新方法分析孕妇外周血的cffDNA的浓度和长度均值是有效的、准确的.

  • 炎症影响下血管平滑肌细胞神经传递中相关基因的研究

    作者:田众一;邓颖;汤敬东

    血管平滑肌细胞的排列紊乱和肥大在血管病中十分常见,炎症在疾病的发展过程中扮演了关键角色.为了研究炎症对血管平滑肌细胞神经传递的作用,笔者在二代测序后进行了生物信息分析.对经LPS处理的A7r5细胞和经PBS处理的A7r5细胞的基因经二代测序测序,重复三次.差异基因表达集通过R框架下的NOISeq软件包取得.随后,通过DAVID数据库获得功能和通路富集分析来推断其潜在功能.蛋白富集通路的相互作用关系与神经系统疾病有关,这些蛋白与ADRA1D或CACNA1S有关,这一结果通过使用Cytoscape软件构建的STRING和PPI网络得到.相较于对照组LPS组中共计2038个基因有差异表达,包括1094个基因上调、944个基因下调.富集分析提示NADH中NDUFV2与多种神经系统疾病相关,包括氧化磷酸化、阿尔兹海默症、帕金森症和亨廷顿舞蹈症.而且,NDUFV2在差异基因PPI网络的通路富集分析中也与神经系统疾病有关.在通过PPI网络分析ADRA1D、CACNA1S和差异基因与之的相互关系中,PHB、OXTR、CRMP1和DPYSL2都和ADRA1D、CACNA1S交互作用.目前研究提示NDUFV2、PHB、OXTR、CRMP1和DPYSL2可能是炎症对血管平滑肌细胞的神经传导的作用中的关键基因.

  • 多位点二代测序肿瘤体外诊断产品分析

    作者:高宇;吴传松

    美国FDA批准基于二代测序(NGS)的肿瘤相关基因468位点检测产品上市.文章从产品本身、审批过程等方面对该产品的上市进行分析阐述,以期为研发人员对该产品的理解及相关政策制定给予参考.

  • 二代测序技术在一起食源性疾病事件病原鉴定中的初步应用

    作者:汪皓秋;俞骅;郑伟;张蔚;刘涛;楼秀芹;黄春萍;黄利明;沈利明;潘劲草

    目的 分析一起食源性疾病事件中病原的基因组学特征.方法 选取事件中死亡病例血样和洗胃前胃内容物,以及其就餐食物作为样品,共11份,对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌以及有毒物质进行检测,并对食物中检测到的细菌进行计数.采用实时荧光PCR方法检测分离得到的10株蜡样芽胞杆菌的16 S rDNA保守区基因和呕吐毒素ces基因,并采用二代测序技术对分离株进行了基因组测序,初步分析质粒携带情况,并与公共数据库中参考序列进行比较基因组学分析.结果 所有样品中,仅蜡样芽胞杆菌检测阳性,其中蛋炒饭中蜡样芽胞杆菌计数为1.9×107 CFU/g,干炸鱼和卤猪头肉中均为3.0×103 CFU/g.10株分离株均携带hlyⅢ、nheA、nheB、inlA、inhA毒力基因;携带plcR和nheC基因的菌株均为9株.分离株16 S rDNA保守区基因和ces基因均为阳性,而且均携带完整的ces基因簇序列,并且与分离自英国的AH187株携带的呕吐毒素质粒pCER270(NC_010924.1)和分离自日本的NC7401株携带的质粒pNCcld(NC_016792.1)的序列完全一致.质粒比对结果显示,分离株序列与炭疽杆菌的pXO1和pXO2质粒差异较大,但携带含ces基因的pNCCld质粒.10株分离株基因组系统发生树显示,10株蜡样芽胞杆菌高度相似(系统发生树上距离为2.0×10-6~9.0×10-6)且与AH187株和NC7401株均高度相似(均属ST26型,系统发生树上距离均为3.8×10-5~4.5×10-5).结论 本次食源性疾病事件由不携带pXO1、pXO2质粒的呕吐型蜡样芽胞杆菌污染蛋炒饭引起.提示蜡样芽胞杆菌引起呕吐型食物中毒可能与携带ces基因的ST26、ST164等型别菌株相关.

  • 应用二代测序技术研究HIV准种进化的相关进展

    作者:张晶;邢辉

    近十年二代测序技术快速发展,与一代测序技术相比具有通量高、速度快、灵敏度高、准确率高等优点,主要以454焦磷酸测序、Illumina测序、Ion Torrent测序和SOLiD测序为代表.二代测序技术在HIV领域的研究已经越来越广泛,本文介绍了上述四种二代测序技术在HIV准种进化方面的应用.

  • HIF-1α基因启动子-1946位点 基因多态性与紫绀型先天性心脏病低氧耐受的相关性

    作者:欧阳娜;田鹤锋;刘玲娟;田杰;吕铁伟

    目的 研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因多态性与紫绀型先天性心脏病(CCHD)低氧耐受能力是否具有相关性.方法 用靶向捕获技术,对97例CCHD患儿和108例非紫绀型先天性心脏病(ACHD)患儿HIF-1α基因二代测序;生物信息学分析后找出差异分布的多态位点;用Sanger测序验证.针对HIF-1α启动子区多态位点,构建不同基因型HIF-1α启动子-荧光素酶报告基因载体;转染HEK293T和H9C2细胞;用双荧光素酶报告基因检测系统,分析HIF-1α不同基因型启动子活性.结果 CCHD组HIF-1α启动子区-1946位点A碱基删除变异频率高于ACHD组(P<0.05).与AA基因型比较,DD基因型HIF-1α启动子转录活性更高(P<0.05).结论 HIF-1α基因-1946位点与CCHD耐受低氧能力相关,DD基因型HIF-1α转录活性明显增高,可能是耐受低氧的分子遗传学机制之一.

  • 血管生成素样蛋白8基因罕见突变与严重高三酰甘油血症

    作者:杨颂;杨云云;焦晓璐;朱苗苗;李娟;秦彦文

    目的 在严重高三酰甘油血症人群中筛查血管生成素样蛋白8(ANGPTL8)基因新突变.方法 对43例严重高三酰甘油血症患者进行目的基因靶向捕获测序,排除已知的三酰甘油代谢相关基因突变,筛查ANGPTL8突变,并进行Sanger测序验证,结合功能性预测和保守性分析,终筛选出可疑致病突变.结果 经过生物信息学分析,在43例严重高三酰甘油血症患者中筛选出1个新的ANGPTL8罕见突变,为可疑致病突变.结论 本研究在严重高三酰甘油血症患者中发现了ANGPTL8新的罕见突变.

  • 分子病理实验室设计要求及体会

    作者:杨军;张标;叶庆

    分子病理学是一门年轻的科学,许多方面(包括实验室场地建设)都存在许多值得探讨的问题.国家卫计委2014年发布的《临床实验室生物安全指南》中指出,临床实验室应参照二级生物安全实验室(BSL-2)实现分区及分流[1].实验室应根据自身需求,以“各区独立,防止污染”为原则,增减各功能区.

  • 长角血蜱细菌群落结构及多样性研究

    作者:韩娜;张琳;张雯;强裕俊;侯学霞;陈晨;郝琴;张媛媛

    目的 了解长角血蜱细菌的群落结构及种群多样性.方法 应用Illumina Miseq PE300二代测序技术测定长角血蜱细菌16S rDNA基因的V3~V4高变异区段序列,分析其细菌的群落结构、种群多样性、优势菌群以及常见病原菌的分布.结果 获得用于分析的序列和OTU数目分别为1 070 624条和145 479个;香农多样性指数的稀疏曲线接近平台期,说明此次测序的深度合适,可充分代表长角血蜱细菌的实际种群结构.长角血蜱微生物优势菌群依次为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中以γ-变形菌纲相对丰度高.长角血蜱的“核心微生物群”,聚集成2个“蜱簇”,GⅠ和GⅡ簇分别有21和11个特有微生物群.发现菌群中存在大量致病菌和条件致病菌,但未检测到螺旋体和支原体.结论 野外长角血蜱携带的微生物物种组成和丰度均表现了较大差异性.

  • 二代测序在AML/MDS诊治中的应用研究

    作者:程焕臣;刘生伟;刘宇;赵雪飞;李蔚;邱林;马军

    目的:采用二代测序(next generation sequencing,NGS)检测AML/MDS相关基因突变,分析各基因在AML和MDS中的突变情况及NGS的敏感性,评估基因突变作为MRD监测及疾病进展预测的可行性.方法:标本取自2015年8月至2016年6月在哈尔滨血液病肿瘤研究所诊治的初发AML(68例)和MDS(57例)患者,采用上海源奇生命科技有限公司的AML/MDS-NGS芯片检测22个相关基因突变.结果:TET2是AML(55.9%)和MDS(56.1%)中突变率高的基因,在AML中突变率次之的基因为CEBPA(11.8%)、DNMT3A(7.4%)、C-KIT(7.4%)和FLT3(7.4%),在MDS中为U2AF1(10.5%)和SRSF2(10.5%).除TP53和CEBPA基因外,其他基因均有特定突变位点.复检的5例AML患者缓解时与初发时相比,FLT3、C-KIT和CEBPA基因突变均转阴,而伴随的TET2基因突变率无明显变化,而5例MDS患者缓解与初发时各基因的突变率无明显变化,其中3例MDS患者发生了疾病进展,疾病进展时出现新的基因突变,但缓解后基因突变率也无明显变化.结论:AML和MDS中均有其特定突变基因和突变位点,一些基因突变如CEBPA等可作为AML中MRD监测的有效指标,但在MDS中仅可用于预后及疾病进展评估.

  • 目标序列捕获测序检出红细胞丙酮酸激酶缺乏症PKLR基因新的复合突变

    作者:李栋梁;张静;刘艳丽;焦保全;王志伟;王友君;李文静;侯兰芬;郭宏谋

    目的:探讨红细胞丙酮酸激酶缺乏症(pyruvate kinase deficiency,PKD)的分子发病机制.方法:应用目标序列捕获和高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)对临床拟诊PKD患儿的PKLR基因12个外显子及其侧翼序列进行测序,采用SIFT及PolyPhen-2数据库预测突变对蛋白质功能的影响,在确定患者致病基因型后,应用Sanger测序技术对此基因型进行验证.结果:NGS结果显示,患儿PKLR基因存在罕见的双重杂合突变:第5外显子661G> A(Asp221Asn)和第10外显子1528C> T(Arg510Ter),导致该基因的第221位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺,第510位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子,使PKLR基因氨基酸链编码提前终止;Sanger测序技术进一步验证了该双重突变的存在.检索相关文献及数据库显示,这两种突变在人群中的发生率极低,蛋白质功能预测均显示为有害.结论:PKLR基因661 G>A与1528 C>T双重杂合突变是该PKD患儿的分子发病机制,PKD患者同时存在上述复合突变的报道在国内外尚属首次.

  • 利用二代测序技术在不明原因发热的血液样本中检测到人细环病毒

    作者:张益;芜为;王佶;申辛欣;何小周;杨梦婕;马学军

    目的 阐明不明原因发热(fever of unknown origin,FUO)的血液样本中用常规方法难以检测到的潜在病原.方法 利用二代测序技术序列非依赖的特性对病原核酸进行随机捕获,随后采用多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行富集.在得到测序结果后,进行宏基因组数据分析,构建进化树,终实现对未知病原的鉴定.结果 对10份不明原因发热的血液样本进行宏基因组二代测序分析时未发现引起发热的常见病原体序列,但发现了大量人细环病毒(Torque teno Virus,TTV)存在的现象.将所有相关测序读长进行组装拼接,并计算得到的一致性序列在匹配的参考序列上的基因组覆盖度.在对组装出的置信序列进行进化分析后,发现其分属于αTTV、β TTV和γ TTV三个属.结论 对本研究中发现的TTV的基因组特征、进化特征以及作为免疫水平评估的意义进行了分析.而对于本研究中只检测出三个属的TTV的现象,可能是因为TTV具有潜在的病原性以及感染性疾病所导致的宿主免疫水平低下,也有可能是由于其他非感染性病因导致的宿主免疫水平降低所导致.

  • 基于核酸杂交的病毒基因组特异性纯化富集方法的初步研究

    作者:王利静;刘林;李建东;李伟红;张硕;梁米芳;李德新

    目的 探索实验室高通量检测前临床样本中病毒核酸特异性纯化富集的方法.方法 以负链RNA病毒发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)为模拟样本,针对病毒基因组S、M和L三个片段设计杂交探针,并进行5'端生物素修饰,与链霉亲和素修饰磁珠共价结合,纯化样本中SFTSV核酸,比较研究特异性纯化富集对样本二代测序效果的影响.结果 cDNA文库制备时全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化均较不开展富集纯化有显著改善,有效数据比例分别为5.57%、6.39%、2.71%,差别具有显著性(x2=9 799.8,P<0.001).对全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化对测序结果进行比较分析时发现,扩增后进行纯化优于扩增前(P<0.001).结论 基于核酸杂交的病毒基因组特异性富集纯化方法可有效降低二代测序中背景值,提高测序效率,具有高通量检测前特异性纯化富集样本的作用.

  • 杭州地区甲型副伤寒沙门菌基因组流行病学的初步研究

    作者:汪皓秋;俞骅;郑伟;郑之北;潘劲草

    目的 了解近年来杭州地区甲型副伤寒沙门菌的基因组流行病学特征.方法 采用二代测序技术(NGS)对2002—2013年杭州地区分离的60株甲型副伤寒沙门菌代表株进行测序并下载公共数据库中的391株甲型副伤寒沙门菌基因组数据.以ATCC9150基因组为参考序列,鉴定所有基因组的单核苷酸多态性(SNP)位点并去除重组,构建基于SNP位点的系统发育树.用SRST2和多位点序列分型(MLST)工具扫描获得MLST型别,用SISTR扫描获得核心基因组多位点序列分型(cgMLST)型别,用SRST2和BLASTN扫描获得耐药基因.选择7种抗生素对60株杭州菌株进行药物敏感试验.结果 451株甲型副伤寒沙门菌基因组序列去重组后共鉴定得到19258个SNP位点,菌株平均距离为0.0070,距离小于0.05的占96.73%,提示451株甲型副伤寒沙门菌基因组差异较小.58株杭州ST85型分离株基因组序列高度相似,提示2002—2013年杭州地区甲型副伤寒疫情主要由ST85型菌株克隆传播引起.杭州菌株与5株国内5省菌株遗传距离较远(平均距离为0.057),与15株云南菌株距离较近(平均距离为0.0032),与柬埔寨菌株的距离近(平均距离为0.0018),提示ST85型菌株存在跨国传播的可能性.2株杭州ST129型分离株中,HZ333与分离自江苏的两株菌近源(平均距离为0.0097),提示ST129型部分菌株存在国内传播的可能性.60株杭州菌株除2株未分型外,其余58株菌被分为9个cgMLST型别;公共数据库中391株菌除57株未分型外,其余334株菌被分为165个cgMLST型别.60株杭州菌株均携带耐药基因,其中56株菌携带aac6-Iy耐药基因,4株菌携带aac6-Iaa耐药基因;公共数据库中的391株甲型副伤寒沙门菌除了13株菌未携带耐药基因,其他378株菌均携带aac6-Iy耐药基因.60株杭州菌株中56株菌对7种抗生素均敏感;3株菌对复方新诺明耐药;1株菌对氨苄西林、四环素耐药.结论 2002—2013年杭州地区甲型副伤寒疫情主要由ST85型菌株克隆传播引起,该型菌株存在跨国传播的可能性;ST129型部分菌株存在国内传播的可能性.SNP位点分析技术分辨力高于脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,能够帮助我们更为精准的对疫情进行溯源.aac6-Iy是全球范围内甲型副伤寒沙门菌普遍携带的一种耐药基因.二代测序技术在传染病防控中有着良好的应用前景.

  • 二代测序在单基因糖尿病中的应用

    作者:饶翀;肖新华;于淼

    二代测序技术是基因检测方法的一次改革,为以新生儿糖尿病和青少年起病的成年型糖尿病为代表的单基因糖尿病的早期基因学诊断和研究开阔思路,并在探索新基因中展现出巨大优势。

  • 基于高通量测序的2型糖尿病易感基因靶向测序panel设计及临床应用

    作者:李春瑞;邢玉华;裴智勇;刘满姣;陈禹保

    目的 利用高通量测序(NGS)和多重PCR技术设计基于扩增子的靶向测序panel,对T2DM易感基因进行测序,并评估其与T2DM患者临床特征的关系.方法 通过Illumina测序平台,设计多重PCR扩增的靶向测序panel,对16个T2DM易感基因21个SNP位点进行测序.收集1043份确诊T2DM患者的外周血DNA样本进行检测.结果 PCR扩增子在不同样本之间的测序深度具有良好的可重复性,且不同扩增子测序数据分布具有高度一致性,除rs864745和rs712523外,测序深度达到1000×以上.18个SNP位点差异均有统计学意义(P<0.05).结论 通过NGS技术,利用基于扩增子的靶向测序panel进行T2DM易感基因检测的可行性和实用性,验证了KCNQ1、CDKAL1、CDKN2B是T2DM发病的风险基因.

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