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HCV核心蛋白致细胞癌变机制的研究进展
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染经常导致受感染个体的持续性感染,并进一步发展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)[1],因此危害极大.已经证明HCV核心(core)蛋白具有多种生物学功能,能与许多病毒、细胞基因及其产物相互作用,很可能参与了HCV的致病过程.文章主要综述了近年来关于HCV core蛋白在HCV感染的致癌过程中可能参与的有关机制的研究进展.
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HCV核心蛋白对HepG2细胞microRNA表达谱的影响
目的 分析HCV核心蛋白(HCV-Core)对HepG2细胞microRNA表达谱的影响.方法 将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/HCV-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染HCV-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-HCV Core细胞系.然后用反转录聚合酶链反应(RT-PCR),细胞免疫荧光和Western blot对HCV核心蛋白在HepG2细胞里mRNA和蛋白水平的表达情况进行验证.利用博奥生物公司的miRNA Array基因芯片,分析稳定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞和转染空质粒pCDNA3.1(+)的HepG2细胞二者microRNA表达谱的差异,后用Taqman探针荧光定量PCR法进行验证.结果 感染HCV-Core后,HepG2细胞表达有差异的microRNA有8种,用Taqman探针荧光定PCR法进行分析,发现HCV核心蛋白可以上调miR-29、miR-146a、miR-149、miR-192、miR-221、miR-222和miR-193b,下调miR-196a.结论 HCV核心蛋白可以诱导肝细胞microRNA表达谱发生改变,在肝癌发生发展过程中发挥重要作用.
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HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性
目的 探讨HCV核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响.方法 以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp,-837～-27 bp,-1 202～-27bp,-1 619～-27 bp,-2 029～-27 bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒.将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性强区域；分别用编码HCV核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用.结果 SFRP1启动子区域-407～-27 bp片段活性强；与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31 ±4.45倍(P＜0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56 ±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P＜0.01)；HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8％ ±1.0％ (P＜0.01).结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关.
关键词： SFRP1 启动子 荧光素酶报告基因载体 HCV核心蛋白 -
HCV核心蛋白、p53、Mdm2及Bcl-2在HCC中的表达意义
目的:探讨HCC组织中的核心蛋白、突变p53、Mdm2、Bcl-2的表达以及其相关性,探讨HCV核心蛋白是否有可能促进p53突变、Mdm2和Bel-2的表达.方法:收集手术切除HCC组织42例,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织核心蛋白、突变p53、Mdm2、Bel-2的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系.结果:C蛋白、p53、Mdm2和Bcl-2在HCC癌组织中的表达率分别为40.5%、47.6%、75.6%、83.3%;4组强度等级资料Kruskal.Wallis秩和检验H=19.01,差异性显著(p=0.000),Mann-Whimey U test:C蛋白和p53、Mdm2、Bcl-2蛋白问的P值分别0.43、0.009、0.00;C蛋白与突变p53、Bcl-2阳性强度两者间相关性检验P值分别为0.000、0.914,相关系数rs分别为0.67、0.08;突变p53与Mdm2、Bcl-2两者相关性检验P值为0.000、0.27,相关系数rp为0.72、0.32.结论:在HCV核心蛋白表达的HCC中核心蛋白可能促进野生型p53突变和表达;突变p53很可能促进Mdm2的表达;核心蛋白和突变p53都有可能促进Bcl-2蛋白的表达;HCV相关的HCC中这些蛋白的变化很可能促进肝细胞增殖或恶性生长.
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丙型肝炎病毒核心蛋白的研究进展
丙型肝炎是由HCV感染引起的传染性疾病,主要通过血液传播.超过70%的HCV感染者可发展为慢性肝炎、肝硬化.甚至肝细胞癌[1-3],但其发病机制不明确.目前的研究表明,HCV核心蛋白是一种多功能蛋白,它不仅具有致癌潜力.而且在HCV所致的慢性肝损伤如脂肪变性、肝硬化等病变中也有重要作用.本文就HCV核心蛋白的生物学功能及其致病机制的新研究进展做一综述.
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HCV肝炎肝硬化中核心蛋白、p14ARF和p21WAF1的表达
目的检测HCV肝炎、肝硬化组织中的核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的表达及其相关性,探讨HCV核心蛋白对p14ARF、p21WAF1的表达作用.方法收集HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织23例,采用免疫组织化学EnVision两步法检测HCV感染的肝炎、肝硬化组织的核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的表达,并分析三者间的关系.结果核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的阳性表达主要定位于细胞核. 在核心蛋白均阳性的组织中,p14ARF的阳性表达率为69.6%,p21WAF1表达率为13%;三组间的阳性强度比较,差异有显著性(P=0.01),HCV核心蛋白与p14ARF、p21WAF1各组间的P值均<0.01;HCV核心蛋白与p14ARF、p21WAF1阳性强度两者间相关性检验,相关系数rs分别为-0.053、0.45(P值分别为0.72、0.20),表明无相关性.结论 HCV核心蛋白对p14ARF、p21WAF1的表达有影响:可能间接促进p14ARF的表达,但抑制p21WAF1的表达.
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HCV核心蛋白、突变p53和Bcl-2在HCC中的表达及相关性
目的探讨HCC组织中的核心蛋白、突变p53、Bcl-2的表达以及其相关性,探讨HCV核心蛋白是否促进p53突变和Bcl-2的表达.方法收集手术切除HCC组织42例,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织核心蛋白、突变p53、Bcl-2的表达,用统计学分析三者间的关系.结果C蛋白、p53和Bcl-2在HCC癌组织中的表达率分别为40.5%(17/42)、47.62%(20/42)、83.3%(33/42);3组强度等级资料Kruskal-Wallis秩和检验H=16.33,差异性显著,Mann-Whitney U test:C蛋白和p53、Bcl-2蛋白间的P值分别0.43、0.00;C蛋白与突变p53、Bcl-2阳性强度两者间相关性检验P值分别为0.000、0.914,相关系数rs分别为0.67、0.08;突变p53与Bcl-2两者相关性检验P值为0.27,相关系数rp为0.32.结论3种蛋白的表达有相关性;HCV核心蛋白可能促进野生型p53突变和表达;核心蛋白和突变p53都有可能促进Bcb2蛋白的表达.
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HCV核心蛋白对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响
目的:观察HCV核心蛋白对低侵袭性人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响.方法:将HCV核心蛋白的原核表达质粒pcDNA3.0-C-EGFP转染SMMC-7721细胞,以空质粒pcDNA3.0(-)转染的细胞作对照.分别采用RT-PCR、Western blot和ELISA法检测转染细胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白及培养上清中蛋白的表达水平;进行纤维连接蛋白黏附实验、侵袭实验及运动实验,MTT法观察细胞增殖情况.结果:重组质粒pcDNA3.0-C-EGFP转染的SMMC-7721细胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白及培养上清中蛋白的表达水平,细胞黏附率,侵袭实验及运动实验穿膜细胞数均高于对照(t=8.141、5.762、19.931、2.961、4.112和4.213,P均<0.05).pcDNA3.0-C-EGFP转染的SMMC-7721细胞增殖率也较对照明显增加(P<0.05).结论:HCV核心蛋白外源基因可促进SMMC-7721细胞系的增殖.
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HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响
目的 利用腺病毒表达系统,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白对HepG2细胞增殖、Wnt1以及microRNA152(miR-152)表达水平的影响.方法 通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-HCV core,分别感染HepG2细胞后,通过RT-PCR和Western blot证实HCV核心蛋白在HepG2细胞中高效表达.MTT法、细胞周期测定和克隆形成实验检测HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响.SYBR探针荧光定量PCR和Western blot检测的HepG2-HCV core细胞中Wnt1和miR-152表达的变化.用miR-152 inhibitor转染HepG2细胞后,SYBR探针荧光定量PCR、Western blot检测HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达水平变化.结果 Ad-GFP和Ad-HCV core腺病毒经HEK293扩增后滴度分别为1.5×109 pfu/mL和1.6×1010pfu/mL.Ad-HCV core腺病毒感染HepG2细胞后,HCV核心蛋白高效表达.感染48 h后,与HepG2-Mock细胞相比,Ad-HCV core可显著促进HepG2细胞增殖(P＜0.05),加快G1/S细胞周期进展(P＜0.05),并促进细胞克隆形成(P＜0.05).Ad-HCV core腺病毒感染可在显著上调HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达量(P＜0.05)的同时下调miR-152表达水平.同时,miR-152 inhibitor可显著上调Wnt1 mRNA和蛋白水平.进一步生物信息学分析显示,Wnt1基因mRNA 3'-UTR含有miR-152结合位点.结论 HCV核心蛋白可能通过抑制miR-152而减弱其对Wnt1 mRNA的降解及翻译阻碍作用,进而达到上调Wnt1致Wnt信号通路激活,促进肝癌细胞增殖的效应.
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用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白
目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.
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用细胞爬片和石蜡切片对HCV核心蛋白进行免疫组化染色的比较
用培养的细胞进行免疫组化染色时,可采用两种方法:细胞爬片和石蜡切片.虽然细胞爬片具有方便、快捷等优点,但也受到一定的限制.如抗体的结合部位位于细胞核时,由于细胞膜的障碍、穿透效果不佳;贴壁不牢的细胞在染色振洗过程中可发生脱落.这样不仅可降低检测的敏感性,甚至可出现假阴性的结果.而用细胞石蜡切片则可克服上述缺点,扩大检测的范围.本研究中,我们将培养的肝癌细胞株HepG2分别制作成细胞爬片和石蜡切片,用抗HCV核心蛋白的mAb做免疫组化染色,检测了HCV核心蛋白的表达,并对两种标本片检测的结果进行了比较.
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HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用
目的:探讨HCV-core与HCBP1的相互作用.方法:PCR分别扩增含HCV Pore及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEM T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果:CAT-ELISA检测显示pM-core与pVP16·HCBPl实验孔A405 nm值为0.1288,高于其它阴性对照,但低于阳性对照组A值.结论:哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1有一定的相互作用,可进一步研究HCBP1的细胞功能.
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HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测
目的: 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法: PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段,HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用. 结论: 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能.
