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核酸疫苗的研究进展
核酸疫苗是利用病原的保护性抗原构建真核表达质粒,再将质粒DNA导入机体细胞,使外源基因借助于机体内源性表达系统表达并提呈给宿主免疫系统,诱导产生特异性的免疫应答反应的新型基因工程疫苗.1.3.1 Kodi血凝素lli等文中构建了编码H5N1人流感分离株A/HK/156/97血凝素的核酸疫苗,动物实验表明该疫苗诱导小鼠产生了抗H5N1感染的免疫反应,对在血凝素第154位没有糖基化位点的人A/HK/156/97(H5N1)病毒和在血凝素第154位具有糖基化位点的鸡A/Ck/HK/156/97(HSN1)病毒均具有抗性[11].DNA免疫还具有高度安全稳定,不受宿主种属特性及免疫状态限制和不干扰血清学调查的特点,而且DNA疫苗接种还被认为是消灭和控制流感大流行的一种快速、有效的方法[12].
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含Aβ1-15的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析
目的:原核表达并纯化含β -淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)氨基段15肽(Aβ115)和删除c/el表位的截断型HBcAg的融合蛋白,观察其形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)基因工程疫苗的研究提供基础.方法:将合成的A β 1-15基因连接于HBcAg的1～71的3 ′端,再将HBcAg的88～144位氨基酸的基因片断连接于Aβ1.15的基因的3′端,构建重组质粒pUC/c-Aβ15-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET/ c-A β 15-c.异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D- 1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导、SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测重组基因的表达.表达的融合蛋白(命名为CA15C)纯化后,透射电镜观察病毒样颗粒的形成.以病毒颗粒抗原CA15C腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-A β抗体的滴度.结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,目的基因重组于表达质粒之中,与理论设计相符.诱导表达后,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见表达蛋白CA15C,以沉淀中为多,约占细菌沉淀总蛋白的40％.电镜下可见纯化后的CA15C形成直径约30 nm的病毒样颗粒.昆明小鼠经CA15C免疫5次后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶10000,且检测不到抗-HBc抗体.结论:原核表达制备的含Aβ 1.15和HBcAg的融合蛋白CA15C,可形成病毒样颗粒,有较强的免疫原性.
关键词： β-淀粉样肽(A β) HBcAg 融合蛋白 病毒样颗粒 基因工程疫苗 -
赖型钩端螺旋体与非致病钩端螺旋体差异基因片段的筛选与鉴定
目的:利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),比较致病与非致病钩体之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段,以分析钩体毒力相关基因.方法:以赖型钩体017株为tester,非致病性patoc Ⅰ株为driver进行SSH.用3种四碱基内切酶RsaⅠ、HaeⅢ、AluⅠ分别酶切基因组DNA,选择适内切酶消化产物(小于2 kb的片段),连接特殊设计的Adaptor进行消减杂交的PCR,得到消减混合物,与T/A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blotting筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和相似性分析.结果:AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段;经PCR和Southern blotting筛选鉴定得到25个致病钩体中特异存在的阳性克隆,阳性率达到62.5%;序列测定显示插入片段大小为149-1 506 bp,平均480 bp, GC含量从26.30%到51.98%不等,平均36.63%;相似性分析其中6个片段无任何相似性匹配,18个有一定相似性的序列可分为两类:与外膜蛋白或假想蛋白相关和与生化代谢修饰的酶相关.20个序列已被GeneBank收录,收录号分别为AF300873-AF300877,AF325807-AF325821.结论:SSH是一种有效、灵敏的、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义;利用SSH技术筛选得到的致病钩体特有消减片段很可能与致病钩体的分子进化和毒力有关,也为我国特有微生物的基因资源开发和基因工程疫苗的设计提供给了重要信息.
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CEA分泌性肿瘤疫苗的研究及进展
癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是1965年首先从结肠癌分离出来的一种肿瘤相关抗原，相对分子质量为180 kDa，属于酸性糖蛋白，它存在于2～6个月胎儿的肝、肠、胰腺组织中。正常情况下，消化道细胞分泌CEA进入肠腔，血清中CEA水平低(低于2.5 ng/ml)。细胞癌变后，细胞分泌的极性发生变化，CEA可被分泌入血，使血清CEA水平升高。CEA广泛存在于各种上皮性肿瘤，有82％结肠、直肠癌患者血清中CEA水平升高，胃癌、胰腺癌以及非消化道肿瘤如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等患者中CEA水平亦可升高。非肿瘤患者如溃疡性结肠炎、直肠息肉、肝硬化、甚至长期吸烟者中也可有血清CEA阳性者。然而，CEA在肿瘤细胞上呈高度表达，因此，它可作为主动免疫治疗靶。本文从基因工程疫苗、多肽疫苗、抗独特型抗体疫苗、核酸肿瘤疫苗等几个方面对CEA分泌性肿瘤疫苗综述如下。
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包虫病基因工程疫苗研究进展
包虫病是由棘球属绦虫的幼虫引起，呈全球性分布。细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫分别引起人类罹患囊型包虫病（cystic echinococcosis，CE）和泡型包虫病（alveolar echinococcosis， AE）。包虫病是世界上致命性的人畜共患疾病之一。既往，我国颁布了一些包虫病的防治措施，但由于文化、民族、宗教、信仰等不同，实施难度较大。在该疾病的高发区接种疫苗被认为是保护居民免受包虫病的一种有效方法。近20年，为了能更有效地控制包虫病，在研制针对该种疾病的疫苗方面做了大量工作，取得了一定的进展［1］，尤其近5年随着分子生物学技术的快速发展，使基因工程疫苗的研究更加深入，该方面的进展更是突飞猛进。基因工程疫苗是利用基因重组和分子生物学技术，对病原微生物的基因进行改造、克隆和修饰等复杂程序构建的一种新型疫苗［2－4］，对基因工程疫苗的开拓研究已成为当前疫苗领域的一个热点［5］，本文就近年新研究发现的几种疫苗的研究现状及其发展前景进行综述。
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国产重组酵母乙型肝炎疫苗阻断乙型肝炎母婴传播的研究
目的探讨乙型肝炎基因工程疫苗阻断 HBV母婴传播的免疫保护效果和免疫策略。方法对 HBsAg和 HBeAg 同时阳性母亲的 169例新生儿接种国产重组酵母乙型肝炎疫苗，于免后 3、 9、 12、 24、 36、 48月采血进行血清免疫学追踪观察。结果 22例婴儿 1岁前 HBsAg阳性， 19例（ 11.24％）成为慢性携带者，免后一年阻断保护率为 85.94％。抗 -HBs阳性率和抗 -HBs滴度均于 9～ 12月龄时达一高峰， 24和 36月龄时有所下降，免后 1～ 4年抗 -HBs阳性率分别为 96.43％、 91.07％、 85.19％和 70.00％。结论国产酵母重组乙型肝炎疫苗对 HBV母婴传播具有良好免疫阻断效果。母亲 HBsAg和 HBeAg双阳性的幼儿在 3～ 4岁时需加强免疫。
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乙肝DNA疫苗的研究进展
免疫接种是预防 HBV感染的一项重要措施。第 1代 HBV疫苗以无症状携带者血浆中纯化的 22nm球形亚单位病毒颗粒作为疫苗。第 2代 HBV疫苗由在真核细胞中表达的相同的亚单位病毒颗粒组成 [1]。但是血源疫苗需要大量 HBsAg携带者血浆，又需要较高的灭活技术、成本也较高；基因工程疫苗、全程疫苗需接种 3剂疫苗，这可降低免疫覆盖率， 15％～ 20％的人群对其呈现无应答或应答低下，另外，对有可能逃避现有疫苗保护作用的 HBsAg突变株存在争论 [2]，所以乙肝 DNA疫苗在此基础上应运而生。 1 乙肝 DNA疫苗的组成 1.1 目的基因的选择 HBV 基因组含有多种抗原： preS1基因、 preS2基因、 S基因、 c基因、 e基因、和 X基因。因为 preS1蛋白、 preS2蛋白和 S蛋白均可诱导机体产生相应特异抗体，其中抗 -HBs具有保护力， preS2抗体可能与病毒清除密切相关。 c基因产物 -HBcAg是机体特异性 CTL的主要靶抗原。所以目前目的基因的研究主要集中在 S， S1， S2基因 [3]和 c基因 [4]。1.2 质粒载体的选择因涉及到 DNA 疫苗的安全性，美国 FDA已规定应用于人体的质粒 DNA疫苗不应含有氨基甙类抗生素（如氨苄青霉素）抗性基因，他们推荐使用含卡那霉素和新霉素等抗性基因的表达载体。国内学者袁正宏等分别构建插入 HBV表面抗原编码基因的表达载体 pcDNA1.1/SA（无抗性基因）和 pcDNAI/AMP/SA（含氨苄青霉素抗性基因），发现 pcDNAI/AMP/SA的免疫效果优于 pcDNA1.1/SA， pcDNA1.1/SA的免疫效果可被 CpG免疫刺激元件（ ISS）增强，而 pcDNAI/AMP/SA诱生特异性免疫应答的能力则被 ISS抑制 [5]。另外， Waltrand提出：（ 1） HCMV启动子的调节能力较佳。（ 2）在 HCMV启动子控制的 HBV DNA疫苗中，内含子、 neo基因、 HBV X 基因等存在与否意义不大。（ 3） DNA疫苗分子大小对免疫效果可能有影响，因大分子不易被摄取。
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成都地区人群腺病毒中和抗体调查
腺病毒(AdV)是人急性呼吸道感染的主要病原之一[1],也可作为基因工程疫苗载体[2].1990年以来,我们与首都儿研所进行合作,对成都地区人群腺病毒中和抗体进行调查,为本地区呼吸道感染病因和基因工程疫苗载体制备轮状病毒的口服疫苗、预防婴幼儿轮状病毒腹泻提供了流行病学资料.
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流行性乙型脑炎病毒及其研究进展
乙型脑炎是由黄病毒科的乙型脑炎病毒引起的人和动物共患的一种由蚊虫为媒介传播的病毒性疾病.乙型脑炎病毒对人类危害巨大,是人类中枢神经系统常见的虫媒病病毒之一,对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失.
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鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S_1969的克隆表达及免疫保护机制初步研究
目的 制备鲍曼不动杆菌(Ab)A1S_1969重组蛋白,利用小鼠全身脓毒血症感染致死模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,探讨可能的免疫保护机制,为筛选Ab疫苗有效的保护性抗原奠定基础.方法 基于反向疫苗学技术筛选出Ab外膜蛋白A1S_1969,利用pGEX-6P-2质粒构建GST融合表达载体,重组表达的A1S_1969蛋白经亲和层析高效纯化后与铝佐剂吸附制备而成重组A1S_1969免疫原;采用Balb/c小鼠全身感染模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,通过ELISA检测免疫小鼠IgG抗体滴度和IgG抗体亚型.制备A1S_1969重组蛋白抗血清进行体外调理吞噬杀菌实验.结果 成功克隆、表达并纯化A1S 1969重组蛋白,纯度＞90％.动物免疫保护结果显示A1S_1969重组蛋白组小鼠存活率为55.6％,对照组小鼠存活率为20.0％(P＜0.05);末次免疫7d后小鼠体内总IgG抗体滴度为1:64 000,以IgG1亚型为主;体外调理吞噬杀菌实验结果显示A1S_1969特异性血清抗体可以增强中性粒细胞对Ab的杀菌作用,实验组杀菌率可达55％,对照组无杀菌活性.结论 A1S_1969重组蛋白可显著提高全身脓毒血症感染致死模型小鼠的存活率,具有良好的免疫保护效果.
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溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定
目的 构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定.结果 scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基.ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有藻弧菌一样的免疫原性.结论 成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础.
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O型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白疫苗的构建、表达和纯化
目的为了克服灭活口蹄疫病毒疫苗可能存在的传播病毒的潜在危险,构建一种能预防O型口蹄疫病毒感染的VP1表位重组蛋白疫苗.方法采用O型口蹄疫病毒(FMDV)表面VP1蛋白上的B细胞表位肽和T细胞表位肽,以PCR扩增和克隆连接等方法构建VP1表位六聚体重组蛋白(VP1epi)基因,并在大肠杆菌中进行诱导表达,镍亲和层析纯化.用ELISA法检测VP1epi免疫豚鼠血清中抗FMDV抗体的水平.结果构建了一种由FMDV表面VP1中B细胞表位肽重复六次的蛋白质多肽,采用pET28原核表达系统,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产量约占菌体蛋白的30%左右,经镍亲和层析后获得纯度高于90%的VP1表位重组蛋白.VP1epi免疫的豚鼠血清中含有一定量的抗FMDV抗体.结论VP1epi重组蛋白能诱导机体产生抗O型FMDV的抗体,说明这种重组蛋白可能成为预防O型FMDV感染的基因工程蛋白质疫苗.
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含APPβ裂解位点肽及Aβ1-15的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析
目的:构建含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)及删除了c/e1表位的截短型HBcAg基因的原核表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白C-ABCSP-Aβ15-c形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为多表位AD基因工程疫苗的研究奠定基础.方法:PCR扩增含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)的基因,连接于HBcAg的1～71的3’端,再将HBcAg的88～144位氨基酸的基因片断连接于Aβ1-15的基因的3’端,构建重组质粒pUC/c-ABCSP-Aβ15-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,IPTG诱导表达.用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色,观察重组基因的表达.透射电镜观察融合蛋白形成的病毒样颗粒.融合蛋白经腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-ABCSP、抗-Aβ抗体的滴度.结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,重组基因位于表达质粒之中,其大小、序列与理论设计相符.诱导表达后,SDS-PAGE显示,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见到表达蛋白条带,且以沉淀中为多,约占沉淀总蛋白的40％.纯化后的融合蛋白形成电镜下可观察到的病毒样颗粒.昆明小鼠经融合蛋白免疫5次后,其血清中抗-ABCSP抗体的滴度可达1∶5 000,抗-Aβ抗体的滴度可达1∶10 000,检测不到抗-HBc抗体.结论:c-ABCSP-Aβ15-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性.
关键词： β-淀粉样肽(Aβ) HBcAg 融合蛋白 病毒样颗粒 基因工程疫苗 -
重组基因c-Aβ-c的构建及其表达蛋白的免疫原性分析
目的: 构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础.方法: 采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1～71、88～144氨基酸的基因片断(HBc1～71和HBc88～144),以及编码淀粉样肽Aβ1-42的基因.将后者连接于HBc1～71和HBc88～144之间,构建重组质粒pGEMEX/c-Aβ-c,并将重组基因亚克隆于原核表达载体pHGhis中,构建表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,通过温度诱导表达.用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)检测融合基因的表达.以融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度.结果: 经酶切鉴定、DNA序列测定证实,融合基因重组于表达质粒之中,表达质粒与理论设计相符.诱导表达后,表达蛋白约占细菌沉淀的16%.BALB/c小鼠经3次免疫后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶16 000,且检测不到抗-HBcAg抗体.结论: c-Aβ-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性.
关键词： 融合蛋白 β-淀粉样肽(Aβ) 基因工程疫苗 免疫原性 -
幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究进展
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、B细胞淋巴瘤的发生亦密切相关.世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将Hp列为Ⅰ类致癌因子[1].流行病学调查显示,全世界成年人口约50%携带该菌[2].
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轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定
目的:设计获得轮状病毒(RV)新型VP6基因. 方法:本研究在前期工作的基础上,对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究. 我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造. 结果:成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列,该序列长约1220 bp,(G+C)含量达55%. 结论:与野生型RV VP6基因相比,优化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了约20%,这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础.
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汉滩病毒M，S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达
目的 在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段. 方法 将汉滩病毒76-118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7 kb的片段连接，克隆入pGEX-4T2，构建嵌合基因原核表达载体pGEX-4T2-G1S0.7，并在大肠杆菌XL1-Blue中，诱导GST-G1S0.7融合蛋白的表达. 表达产物用ELISA和Western blot进行鉴定. 结果 成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX-4T2-G1S0.7. 经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合. Western blot结果显示，诱导出相对分子质量 (Mr)大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白. 结论 获得具有特异性结 合活性的融合蛋白GST-G1S0.7，为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础.(潘伯荣)
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妇科恶性肿瘤的免疫治疗
肿瘤的免疫治疗是继传统的手术、放疗、化疗之后发展起来的第四种治疗方法.近年来随着分子生物学、免疫学及基因工程学的迅速发展,使人们能在分子水平认识肿瘤的发生、发展及机体的抗肿瘤免疫机理,从而研究出了肿瘤的免疫治疗.疫苗是常用的一种主动免疫疗法,目前研究较多的是肽疫苗,树突状细胞(Dendritic cells,DC)疫苗,基因工程疫苗和抗独特型抗体疫苗.现综述如下.
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妇科恶性肿瘤的免疫治疗
肿瘤的免疫治疗是继传统的手术、放疗、化疗之后发展起来的第四种治疗方法.近年来随着分子生物学、免疫学及基因工程学的迅速发展,使人们能在分子水平认识肿瘤的发生、发展及机体的抗肿瘤免疫机制,从而研究出了肿瘤的免疫治疗.疫苗是常用的一种主动免疫疗法,目前研究较多的是肽疫苗,树突状细胞(Dendritic Cells,DC)疫苗,基因工程疫苗和抗独特型抗体疫苗.现综述如下:
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基因工程乙肝新型疫苗(汉逊酵母表达系统)的开发
HBsAg不同成份在多条生物细胞系统中已表达成功,但至今仅哺乳动物细胞(CHO,C127等)和酿酒酵母表达系统占领了大部分市场.我们的临床观察也证明了酵母重组疫苗对HBeAg和HBsAg双阳性母亲所生的新生儿免疫保护效果好.近年来又发展了汉逊酵母表达系统.其特点为30个adw2HBsAg基因拷贝整合于该酵母染色体中;含有MOX、FMD等高效启动子;能利用甘油、甲醇为能量来源进行高密度发酵,每升发酵液的细胞干重达100 g以上;工程菌发酵生产稳定性好,HBsAg颗粒表达量达400 μg/ml,终纯化的HBsAg达60 μg/ml,其单位产量比酿酒酵母表达系统高约10倍,小鼠实验证明该系统表达的HBsAg诱导体液和细胞免疫应答较好,值得开发出产品,适合于我国广大农村使用.在发展基因工程乙肝疫苗时也应考虑研究增强抗原细胞免疫工程菌的构建和疫苗佐剂.
