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猪逆转录病毒与生物人工肝的使用
生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)或组合型生物人工肝(hybridbioartificial liver,HBL),是目前国内外公认接近自然肝脏,功能也全面的人工肝脏支持系统[1].所谓生物型人工肝,就是在整个治疗系统中包含有活的肝细胞或组织,因此具有相应生物活性的人工肝支持系统.在生物人工肝领域,因为猪解剖、生理特点与人类相似,猪细胞来源广泛,经济适用,因此目前应用多的生物部分是猪肝脏细胞.但目前已知,作为异种细胞猪肝细胞内存在着猪内源性逆转录病毒(porcine endogenousretrovirus,PERV),有引起生物人工肝治疗患者PERV感染的危险.因此,本文就猪内源性逆转录病毒及猪源性生物人工肝的安全性问题作一简要总结.
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生物人工肝系统的生物反应器
目前,生物人工肝系统正在成为急性肝衰竭患者体外有效的肝支持治疗手段,在该系统中,生物反应器起着重要作用.迄今为止,设计和研究的生物反应器已有多种,如平板式反应器、中空纤维型反应器、灌流床式/支架型反应器、肝细胞包裹与悬浮型反应器等.本文介绍了生物反应器的基本作用、功能、条件和要求,并对4类主要生物反应器的研究进展予以综述.
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生物人工肝的基础与临床
随着细胞学、生物工程学的发展,生物人工肝的建立和临床应用已成为研究热点,生物人工肝已成为治疗肝衰竭的新途径.保持肝细胞的活性和功能,在培养液或生物反应器中要有足够的细胞营养成分,同时还要祛除细胞代谢产物,由此已经产生了许多生物人工肝支持装置,有三种装置已经进行了临床实验.本文综述了肝细胞的培养方法及其在生物人工肝中的应用、生物人工肝的研究成果和存在的问题.
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急性肝功能衰竭治疗的研究进展
急性肝功能衰竭是原来无肝病受损后短时间内发生的严重临床综合征,死亡率高.常见的病因是病毒性肝炎.脑水肿是主要的致死原因.除少数中毒引起者可用解毒药外,目前无特效疗法,原位肝移植是目前有效的方法.急性肝功能衰竭(acute livre failure ALF)预后恶劣,死亡率高达70%～80%.其病因学、发病机制、诊断、治疗和预后判断等方面的研究,近年来都有不同的进展.本文重点就其治疗方面的研究进展作简要综述.
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培养于TECA型生物人工肝的猪肝细胞生物转化功能的测定
了解培养于TECA型生物人工肝(BALSS)中猪肝细胞活性和生物转化功能的变化.将新鲜分离的特种猪肝细胞培养于TECA-BALSS的生物反应器中,通过BALSS中空纤维管膜与含盐酸利多卡因的RPMI-1640培养液进行6h交叉灌流.对照组BALSS内无猪肝细胞.采用胎盘蓝染色法测定肝细胞活率.用高压液相法测定利多卡因浓度.结果显示:猪肝细胞在TECA-BALSS中培养6h时,其细胞活率达89.7%;随着交叉灌流时间的增加,其体液环路中的盐酸利多卡因浓度逐步下降,6h时的转化率达80%,显著高于无肝细胞对照组的转化率2.5%(P＜0.01).这表明采用TECA-BALSS可大量的培养猪肝细胞,不仅肝细胞能维持较高的存活率,并能发挥肝细胞的生物转化功能.
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胶原/丝素电纺纳米纤维膜体外培养肝细胞的研究
本实验采用静电纺丝技术制备胶原/丝素纳米纤维支架,对支架上培养的人肿瘤肝细胞HepG2进行形态学观察、细胞功能和代谢功能检测.胶原/丝素纳米纤维支架以六氟异丙醇(HFIP)为溶剂通过静电纺丝技术制备,5种支架材料胶原和丝素配比分别为10∶0、7∶3、5∶5、3∶7、0∶10.扫描电镜结果显示制备的纤维平均直径在550 ～1100 nm之间,随着丝素含量的增加纤维平均直径增加.细胞培养结果显示HepG2细胞在材料表面生长状态良好并与支架材料紧密结合.随培养时间延长,常规培养组细胞在第5d后逐渐死亡,失去细胞功能,胶原/丝素纳米纤维支架组细胞在4～9d内能够维持稳定状态,其尿素合成、蛋白分泌与常规培养组有明显差别,其中丝素含量为50％组的细胞状态和细胞功能高于其它组.实验表明胶原/丝素纳米纤维支架材料细胞相容性良好,较之常规培养细胞增殖效果明显,维持功能表达时间延长,有望用于改善人工肝生物反应器中的细胞活性,维持细胞功能表达.
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壳聚糖纳米纤维支架对猪肝细胞分泌猪内源性逆转录病毒的影响
探讨壳聚糖纳米纤维支架对肝细胞的PERV分泌量以及其感染性的影响.将新鲜分离的猪肝细胞接种于壳聚糖纳米纤维支架或普通条件下连续培养7d,分为实验组（Nano组）和对照组（Hep组）.每天收集培养液检测逆转录酶(RT)活性,并通过RT-PCR和实时定量PCR测定PERV RNA水平.通过western blot检测细胞裂解液中PERV gag 30蛋白含量.细胞培养液体外孵育HEK293细胞以测定其感染性.结果表明:实时定量PCR、RT活性以及western blot具有相似的变化趋势.在体外培养10 h和2d出现PERV分泌高峰然后逐渐下降.除第6dPERV RNA水平和第5d蛋白水平实验组明显高于对照组外,其余均无明显差异.体外感染实验无HEK293细胞感染.壳聚糖纳米纤维支架会延长猪肝细胞的PERV分泌时间但对分泌量以及体外感染性并无明显影响,可安全用于生物人工肝.
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壳聚糖纳米纤维电纺膜体外对肝细胞作用的研究
生物人工肝作为肝功能衰竭的一种有效支持手段,近年来得到很大的进展,但如何长期维持其中肝细胞的活性及功能一直是困扰人们的难题.纳米生物材料的应用为这一问题的解决提供了可能的方案.用静电纺丝的方法将壳聚糖制备成纳米纤维电纺膜,同时采用经典的两步原位胶原酶灌注法分离大鼠肝细胞,观察肝细胞在纳米纤维电纺膜表面的形态,同时检测其活性和功能.肝细胞在壳聚糖纳米纤维电纺膜表面展示了良好的活性,并能与支架材料紧密结合.其尿素合成、蛋白分泌及细胞色素P450的活性均为对照组的1.5～2倍,糖原合成也较对照组有明显增强.壳聚糖纳米纤维电纺膜能促进肝细胞黏附,同时具有良好的生物相容性,从而促进肝细胞的功能,是生物反应器中肝细胞黏附介质的理想材料.
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慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞活力和蛋白合成功能的影响
目的观察慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞株的影响,为研究应用C3A细胞株的生物反应器进行生物人工肝支持治疗提供实验依据.方法用100%正常人血浆(normal human plasma,NHP)和100%慢性重型肝炎患者的血浆(chronic severe hepatitis plasma,CSHP)培养C3A细胞,四甲基偶氮唑盐法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞活力,通过3H-亮氨酸掺入法检测细胞蛋白合成速率,Western-blot分析比较白蛋白合成功能,从细胞活力和蛋白合成方面研究慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞的影响. 结果①连续5天检测100%CSHP培养的C3A细胞活力均明显高于100%NHP组, (t 值分别为 6.26、4.89、3.55、3.94、6.17,P值均小于0.01);②第48h 100%CSHP培养的C3A细胞蛋白合成速率高于100%NHP组,结果差异有显著性(t=5.93,P<0.01);③培养24h后Western-Blot分析可见100%CSHP组白蛋白表达量明显高于100%NHP组.结论 CSHP对C3A细胞的增殖和蛋白合成功能有促进作用.
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生物人工肝肝细胞培养研究进展
近年来,体外人工肝支持系统得到了极大的发展,先后出现了多种模式,Uchino 等[1]将人工肝分为生物型、非生物型、中间型及杂合生物型等四种类型.目前公认以杂合性生物人工肝效果好,是人工肝支持系统(BALSS)的主流模式.杂合性生物人工肝一般由三部分组成:①生物成份;②生物反应器;③血液灌流系统.在这三部分中,生物成份是BALSS的核心,主要为动物或人的肝细胞培养物,发挥肝细胞的合成、代谢、解毒、排泄以及免疫等功能.可以说,获得大量具有良好肝特异功能的细胞是关键,BALSS的效果主要取决于所用肝细胞的功能.本文对近来用于生物人工肝的肝细胞培养的进展作一综述.
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利用重型肝炎患者的置出液进行生物人工肝的体外测试
目的探讨重型肝炎患者的置出液在生物人工肝研究中的应用价值.方法以血浆置换手术中无菌收集的重型肝炎患者的置出液作为重型肝炎模型,在体外研究了猪肝细胞型生物人工肝对置出液生化指标及药物转化代谢的影响.结果重型肝炎患者的置出液经过猪肝细胞型生物人工肝的处理后,置出液中的总胆红素、谷氨酰转肽酶、胆碱酯酶、血糖、胆固醇及糖化血红蛋白的水平出现下降,总蛋白、白蛋白、甘油三脂水平增加,加入置出液中的氨茶碱浓度迅速下降.结论重型肝炎患者的置出液能反映出生物人工肝对糖、蛋白质、脂肪等物质代谢产生的影响及对药物的转化代谢活性.重型肝炎患者的置出液可作为重型肝炎模型,在研究生物人工肝的疗效研究中具有重要的应用价值.
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组合型生物人工肝治疗重型肝炎肝衰竭的护理要点及体会
组合型生物人工肝(hybrid bioartificial liver,HBL)是将血浆或血液灌流,血浆置换等非生物型人工肝支持方法,与体外培养的活肝脏细胞结合构成的新型人工肝支持系统[1].
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应用组合型生物人工肝抢救1例暴发性肝衰竭患者的护理
人工肝支持系统(ALSS)治疗重型肝炎在临床上已取得了显著疗效,用于早、中、晚期重型肝炎的治愈好转率分别为90.9%、71.0%和20.5%,说明ALSS治疗早、中期重型肝炎疗效较好.[1]重型肝炎患者由于病情危重,护理上有很大难度,因此,多方面的护理支持显得格外重要.组合型生物人工肝(HBL)是目前国内外新型的人工肝支持手段,它是将培养肝细胞置于生物反应器中,使患者血液或血浆在循环辅助装置的作用下流经生物反应器,通过半透膜或直接与培养肝细胞之间进行物质交换.一般先用患者血浆经非生物型的活性炭或其他吸附装置吸附去除部分毒性物质,而后再进入生物反应器中循环,因为该方法具有非生物及生物两种人工肝的特性,故称HBL.[2]我院于2001年1月9日收治1例暴发性肝衰竭、肝性脑病、肝昏迷Ⅳ度的危重患者,在经过两天的抢救后,病情仍未改善,首次应用HBL治疗获得了成功.现将此例患者的护理体会报告如下.
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在治疗肝硬化时骨髓干细胞的选择与分析
肝硬化是大多数慢性肝病的共同病理结局,肝硬化进入失代偿后将导致肝功能衰竭,目前有效的方法是原位肝移植,但由于供体缺乏、手术费用高和长期使用免疫抑制剂等因素阻碍其广泛应用;生物人工肝和肝细胞移植同样因为肝细胞来源有限而存在局限性.近年来,干细胞技术研究已在医学领域中取得了令人瞩目的成果,其中骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化具有一定的效果,这也为终末期肝病的治疗提供了新思路[1-6].本文结合文献分析对治疗肝硬化时骨髓干细胞类型的选择以及是否进行移植前诱导进行了探讨,现分述如下.
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中空纤维生物反应器的建立及其功能的初步鉴定
目的构建牛物反廊器并评估其生物学功能. 方法采用自主建立的永生化HepG2细胞系为生物材料,以中空纤维构建生物反应器,观察肝细胞在生物反应器内生长情况,同时进行肝细胞功能检测,以肝衰竭患者血浆置换出的废弃血浆作为试验因素,试验性行牛物人工肝治疗. 结果该系统内肝细胞生长良好,每个生物反应器培养72 h后细胞数量达7.60×108个,肝细胞活力保持90%以上.AST、LDH低水平波动;利多卡因转化实验良好;对细胞培养液进行细菌培养监测及支原体检测,均未发现异常.应用肝衰竭患者血浆500ml培养肝细胞6h,总胆红素平均下降98.6 μmol/L.结论建立的永生化肝细胞系应用中空纤维构建生物反应器,肝细胞功能良好,经进一步改进有望应用于生物人工肝治疗.
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生物人工肝临床应用研究进展
人工肝支持系统(artificial liver support system,ALSS)是借助体外机械、化学或生物性装置,暂时替代肝功能,清除各种有害物质,补充生物活性物质,从而使肝细胞得以再生,直至自体肝功能恢复或等待机会进行肝移植的治疗方法.
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无血清培养基培养乳猪肝细胞的效果
目的:比较无血清培养基和含血清培养基培养乳猪肝细胞的效果,以寻找一种用于生物人工肝猪肝细胞无血清培养的良好培养基.方法:采用改良原位两步胶原酶灌注法分离乳猪肝细胞.将肝细胞以5×108@L-1分别培养在无血清培养基和含血清培养基中,动态观察培养7 d中肝细胞活率、蛋白质和葡萄糖合成功能、G6-Pase活性、安定转化功能及LDH漏出量.结果:无血清培养的猪肝细胞各项指标除G-6-Pase活性在0,1,2 d较低、葡萄糖合成功能在2,7 d较低外,其余与含血清培养基培养的肝细胞无显著差异.肝细胞活率随着培养时间的延长而下降,但均高于88%;无血清培养的肝细胞的蛋白质合成功能在培养7 d中保持稳定.安定转化功能在培养2,3 d强(安定浓度2d时为75±4pg@eell-1,3 d时为77±5pg@cell-1);葡萄糖合成功能从1 d时1.00±0.15 nmol@cell-1下降到2 d时0.71±0.02nmol@cell-1;G-6-Pase活性从0d时1290±30zmol@cell-1下降到ld时306±38amaol@cell-1,然后维持在较低水平;LDH漏出量在2,3 d较高.结论:无血清培养基可用于生物人工肝中猪肝细胞的培养.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养时的肝细胞功能
目的:利用原代培养的大鼠肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,研究骨髓间质干细胞对肝细胞功能的影响,以便更好用于肝细胞移植及生物人工肝.方法:采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离大鼠旰细胞,获得有活性生的肝细胞进行原代培养.台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活性;光镜下动态观察细胞形态学改变,并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能.比较肝细胞单纯培养及其与骨髓间质干细胞共同培养时细胞的功能.结果:培养7 d时两组均仍然维持白蛋白分泌及尿素合成功能;共同培养组与单纯肝细胞培养组在白蛋白分泌(13.75＞2.179,P＜0.05)及尿素合成功能(7.27＞2.179,P＜0.05)存在显著性差异,共同培养组明显高于单纯培养组.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,可以使肝细胞维持特异性功能,提高肝细胞活性.
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生物人工肝用C3A细胞在零下非结冰时的保存
目的:探讨零下非结冰保存肝细胞的效果及其与细胞凋亡的关系.方法:UW液保存的C3A细胞悬液分为3组:-0.8℃组(零下非结冰组),0℃组(0℃非结冰组),4℃组(对照组).低温保存24、48及72 h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率及凋亡率,同时测定LDH、乳酸释放,细胞内ATP含量、尿素合成功能及白蛋白分泌功能,同时观察细胞形态.结果:零下非结冰组较0℃非结冰组及对照组明显提高了低温保存72 h的C3A细胞的存活率(86.49%±2.80%vs 81.50%±2.83%.77.83%±3.40%,均P<0.05),降低了细胞凋亡率(1.26%±0.84%vs 5.34%±1.20%,9.16%±1.99%,均P<0.05);明显抑制了低温保存72 h乳酸以及LDH释放(乳酸:10.38μg/106 Cells±1.40 μg/106 cells vs 12.02 μg/106cells±1.64μg/106 cells,17.41μg/10°cells±2.40μg/106cells:LDH:80.10 U/L±11.10 U/L vs 12004U/L±14.32 U/L,148.98 U/L±15.37 U/L,均P<0.05);更好地维持了低温保存72 h C3A细胞内ATP含量、尿素合成功能、及白蛋白分泌功能(均P<0.05).形态上,零下非结冰组保存细胞死亡比例少,细胞接触良好,未见对照组及0℃非结冰组细胞膜周围出现"毛刺"样改变及细胞内的"空泡样"改变.结论:在零下非结冰条件下保存肝细胞,建立一个"血库样"(ready to use)肝细胞库,可以有效促进生物人工肝的发展.
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原代小型猪肝细胞的分离培养及其功能
目的:研究原代小型猪肝细胞的分离、培养及肝细胞的形态学变化及其功能特性.方法:用体外灌流装置,DTA和胶原酶两步灌流法消化分离小型猪肝细胞.在含100 ml/L小牛血清及其附助因子的RPMI 1640培养基中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生化合成及生物转化功能.结果:(1)肝细胞产量为6.0×109～8.2×109(7.0 × 109±0.79×109)/每只猪肝;(2)肝细胞活率为90.0～99%(94.4±3.07%);(3)肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;(4)接种培养后肝细胞增生生长旺盛;(5)接种后20 h内每107个肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.21～1.50 mmol/L及0.58～0.80 g/L;(6)肝细胞数在1.25×107个～1.60×107个时,利多卡因的转化率在24 h时均在80%以上,随着时间的延长及肝细胞数的增多,利多卡因的转化率逐渐增加.结论:本方法分离获取的肝细胞产率高、活性高、增生生长旺盛、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源.
