EB病毒相关胃癌研究进展

世界范围内约10%的胃癌组织中可检测到EBV,研究显示:EBV感染能使原代培养的正常胃上皮细胞永生化,EBV相关胃癌是由一个EBV感染的细胞单克隆增殖形成,提示EBV感染在EBV相关胃癌的发展中起重要作用.本文就EBV相关胃癌的诊断、病毒存在形式和基因表达、影响其发生发展的协同因素以及EBV对上皮细胞的生长促进作用作一综述.

双酚A对大鼠睾丸Leyding细胞的毒性作用

双酚A,又名4-二羟基二苯基丙烷,属低毒性,是制造聚碳酸脂、环氧树脂、聚酚酚树脂及聚氧树脂的重要原料.近年来有报道表明其具有雌激素样作用,影响生殖功能[1,2].睾丸Leyding细胞是合成和分泌睾酮的细胞,并具有高度的调节性,本实验在建立睾丸Leyding细胞离体原代培养的基础上,对双酚A的Leyding细胞毒性进行了初步的探讨.

原代培养人肝细胞的简易高效法

二步胶原酶灌注术分离大鼠肝细胞已比较成熟,但是用大鼠肝细胞所得的实验结果还需外推于人,而人的整肝或肝叶的获取来源极其有限,不宜在一般实验室推广[1].人肝癌细胞、传代肝细胞株等体外虽然容易增殖,但其生物学特性已发生显著变化,因此,原代人肝细胞是公认用来研究药物代谢、酶诱导、移植术、病毒性肝炎和肝细胞再生的体外细胞体系[2].从小量正常肝组织(1～2 g)分离的肝细胞在临床来源广泛,能在体外增殖并存活大约15 d,具有分化功能,可基本满足实验需求.我们建立了操作简便、成本低廉和不需复杂设备的方法,易于在国内推广.

大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较

目的比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和胶原酶、胰蛋白酶两步消化法(简称两步消化法)对大鼠肾细胞分离效果及细胞产量的影响,以及不同培养基(MEM、RpMI1640)、鼠龄(乳鼠、成年鼠)对细胞产量、质量、增殖率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响.方法分别对两组Wistar大鼠(乳鼠和成年鼠)用三种不同的消化方法制备大鼠肾组织细胞悬液,分别在MEM培养液和RPMI1640培养液中原代培养,培养48小时之后第一次传代,观察细胞质量,计算细胞产量,MTT法检测传代细胞24～48小时之间的增殖率,生化分析仪检测传代细胞第1～7天培养液中LDH漏出量.结果胶原酶消化法和两步消化法的肾细胞产量显著高于胰蛋白酶消化法(P＜0.01),两步消化法的细胞质量优于胶原酶消化法,MEM培养液和RPMI1640培养液对细胞产量、增殖率和LDH漏出量的影响均无显著性差异,乳鼠的肾细胞产量显著高于成年鼠(P＜0.01).结论两步消化法对于肾细胞的分离制备尤为适合,MEM培养液和RPMI1640培养液均适于肾细胞的培养,乳鼠比成年鼠更适合肾细胞的制备.

原代肝细胞模型的优化及苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性研究

目的 建立具有高活力、高功能特性的原代小鼠肝细胞模型,并通过该体外模型评价受试物苯乙烯和氧化苯乙烯的急性毒性.方法 以BABL/C小鼠作为肝细胞供者,在经典两步胶原酶消化法基础上进行优化,通过逆向灌流、间断灌注、限制消化时间及Percoll液离心纯化的方式荻取小鼠肝细胞,并进行体外单层和夹层培养;通过细胞形态、细胞活力、胞内糖原颗粒以及上清中各指标即白蛋白(ALB)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及尿素氮(BUN)变化综合评价原代培养的肝细胞模型;以苯乙烯和氧化苯乙烯为受试物,用浓度分别为0.2、1、5、10和25 μmol/L的受试物作用于夹层培养3d的肝细胞,于染毒3、6、12、24及48h后,采用CCK-8法和LDH法测定细胞存活率.结果 改良法分离获取的小鼠肝细胞活力为(90.3±5.2)％,纯度为(95.3±4.2)％,产量达(2.4±0.9) ×107;夹层培养7d内90％以上细胞呈典型的肝细胞形态特征,培养第3d胞浆内可见大量糖原颗粒.ALB分泌、LDH和ALT漏出、BUN合成、以及细胞活力夹层培养在8d内、单层培养在6d内呈波动性变化,且夹层培养法各指标明显优于单层培养法;夹层培养第3d ALB分泌量[(1.42±0.20)g/L]和BUN合成量[(1.97±0.22) mmol/L]及细胞活力均达峰值,而LDH漏出量[(7.30±2.33)U/L]和ALT漏出量[(6.51±1.86) U/L]降到谷值,且3～7d各指标变化相对稳定.苯乙烯和氧化苯乙烯在染毒6h内,对肝细胞显示了较低的细胞毒性,细胞存活率在90％以上,且CCK-8和LDH两种毒性测定方法之间无显著差异;随着染毒时间的进一步延长,CCK-8法检测出的细胞存活率更低(85％以下),与LDH法相比差异有统计学意义.用不同浓度受试物处理肝细胞24h后,从5 μmol/L开始观察到相对较高的细胞毒性,用CCK-8法检测出细胞存活率约为85％,但与LDH法相比无显著差异;随着染毒浓度的继续增加,CCK-8法检测出的细胞存活率更低(80％以下),与LDH法相比差异有统计学意义.结论 改良的胶原酶消化法结合夹层培养法可使肝细胞在较长时间(7d)内维持良好的形态和功能,且用夹层培养3～7d的肝细胞模型可以较准确地评价苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性效应,结合毒性检测指标推测受试物主要影响肝细胞内线粒体亚细胞器的功能,对肝细胞膜的损伤程度影响较弱.

氟化物对原代培养大鼠肝细胞酶活力及超微结构的影响

目的研究不同剂量的氟化物对原代培养大鼠肝细胞存活率、酶活力及超微结构的影响.方法采用半原位胶原酶消化法分离大鼠肝细胞;MTT法检测细胞存活率;赖氏法检测培养液中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性;透射电镜观察细胞超微结构改变.结果氟化钠染毒24小时后肝细胞存活率下降,且呈现明显的剂量-效应关系;2mmol/L和4mmol/L染氟组肝细胞培养液中ALT和AST的活性显著升高(P＜0.05);透射电镜下染氟组肝细胞线粒体肿胀,内质网排列紊乱或断裂.结论过量氟化物对原代培养大鼠肝细胞有明显的毒作用,其主要作用方式是引起细胞膜和细胞器质膜损伤.

甲苯对原代培养海马神经细胞的毒性研究

目的通过在体外对原代培养的海马神经细胞进行染毒,观察其对神经细胞的毒作用,并探讨其作用机制.方法取新生的SD大鼠海马神经细胞进行原代培养,两周后,用甲苯染毒,分成3个染毒组,染毒浓度分别为3、6和9mmol/L,并设空白对照组和赋形剂组,染毒24h,观察其对细胞形态、细胞存活率、LDH漏出率、细胞内游离钙和细胞凋亡的影响.结果甲苯染毒后,细胞的形态发生改变,引起细胞突起萎缩,细胞肿胀变圆,细胞数量减少;神经细胞存活率的显著下降,且随着染毒时间的延长及浓度的升高其存活率逐渐降低;高剂量组神经细胞LDH漏出率的显著升高,与对照组相比有显著性(P＜0.05);细胞细胞内的[Ca2+]i浓度显著上升,与对照组相比P＜0.05,并呈剂量依赖性的变化,加入钙通道拮抗剂硫氮卓酮后,则未见[Ca2+]i浓度上升;可见明显的细胞凋亡.结论甲苯体外染毒对神经细胞有较强的毒性.这可能与甲苯有较强的脂溶性、引起细胞钙内流增加,促进细胞凋亡有关.

培养温度对冻干分枝杆菌菌种复苏的影响

由于全球范围内肺结核及非结核分枝杆菌病的发病呈逐年上升趋势[1],对分枝杆菌的收集、培养和研究是结核病与非结核分枝杆菌病预防、诊断和治疗以及医学科研和教学事业的基础条件[2],中国药品生物质品检定所2007年1月于德国菌种保藏中心引进分枝杆菌菌种229株,均使用改良L-J培养基按其背景资料中记载的温度做原代培养复苏.

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.

人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及生长曲线的绘制

目的 探讨EM异位子宫内膜细胞原代培养方法,并绘制其生长曲线.方法 采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,并观察细胞形态差异.结果 正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率,在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大.结论 注意取材方式,采用改良原代培养方法.可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率有所提高.异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态和活力的差异,是揭示子宫内膜异位症的发病机制的一个有利因素.

吡哆素L-2-吡咯烷酮-5-羧酸酯生殖毒性机制研究

目的 研究吡哆素L-2-吡咯烷酮-5-羧酸酯(MTDX)及其组成物之一VitB6对原代培养睾丸支持细胞分泌乳酸和体外对睾丸合成睾酮的影响,探讨MTDX可能生殖毒性作用机制.方法 胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶两步分离法分离雄性SD大鼠睾丸支持细胞进行体外培养,分别加入不同浓度的MTDX(0.17 g/L,1.7g/L,17.0 g/L和34.0g/L)、不同浓度VitB6(0.1 g/L,1.0 g/L,10.0 g/L和20.0 g/L),24 h后收集培养液测定乳酸含量.利用离体组织培养和放射免疫技术,观察不同浓度的MTDX是否对大鼠睾丸睾酮的分泌有直接作用.结果 与对照组相比,MTDX 17.0 g/L和34.0 g/L剂量组乳酸含量减少;与对照组相比,VitB6 10.0g/L和20.0g/L剂量组乳酸含量减少.MTDX各剂量组和VitB6各剂量组睾丸培养液中睾酮的含量与对照组相比差异均无统计学意义.结论 MTDX可能通过减少了睾丸支持细胞乳酸的分泌而影响生殖细胞的功能,进而影响正常生殖;MTDX对睾丸分泌睾酮没有直接的抑制作用,可能对睾丸间质细胞正常功能没有影响;MTDX的生殖损害可能由其聚合物(组成物)之一VitB6引起.

镉诱导HL-7702细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3的表达

镉是一种有毒的重金属元素,易在体内蓄积,镉对机体毒性效应十分复杂.肝脏是镉损伤的主要靶器官之一,目前对镉致肝细胞损伤机制尚不十分清楚.镉可诱导多种细胞发生凋亡,如大鼠肝细胞、人肝癌细胞株和原代培养的鼠肺上皮细胞等[1-6].

060美商陆种子中的1,4-苯并二噁烷及其对原代培养大鼠皮层神经元的轴突发生活性

柴胡提取物对大鼠海马原代培养神经元5-HT3受体介导离子通道的影响

目的:探讨柴胡提取物(Radix BupleuriExtract,RBE)含药血清对抑郁情绪模型大鼠原代培养的海马神经元5-羟色胺3受体(5-HT3R)通道电流的作用.方法:复制抑郁情绪大鼠模型,以柴胡提取物进行药物干预,采用旷场实验和糖水偏好实验评价模型,制备各组大鼠血清并灭活除菌,对原代培养的大鼠海马神经元干预24 h后,采用全细胞膜片钳技术检测各组神经元5-HT3R通道电流.结果:与正常组相比,模型组大鼠旷场实验总分显著性降低(P＜0.01),糖水偏好系数显著降低(P＜0.01),模型组大鼠血清孵育的海马神经元电流密度值明显增加(P＜0.01);与模型组相比,柴胡提取物组和氟西汀组旷场实验总得分明显提高(P＜0.05,P＜0.01),糖水偏好系数均明显增加(P＜0.05,P＜0.05),柴胡提取物和氟西汀含药血清孵育的海马神经元电流密度值均明显减少(P＜0.01,P＜0.01).结论:柴胡提取物能改善抑郁情绪模型大鼠异常的5-HT3R通道电流,这可能是其发挥抗抑郁情绪的中枢机制之一.

提高新生大鼠原代心肌细胞纯度方法的探讨

目的：探讨提高新生大鼠原代心肌细胞纯度的方法。方法：应用0.08%心肌细胞消化液重复消化出生第1-3天乳鼠的心肌组织多次；收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和。用差速贴壁分离法分离后，加入红细胞裂解液，以除去红细胞，加入溴脱氧尿嘧啶（Brdu）纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育2天，无血清同步化1天。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为1.2×106个，有活力心肌细胞占90%以上，心肌细胞纯度>90%，3-4天后心肌细胞融合成片，并出现自发性节律性搏动。结论：该方法在保证心肌细胞产量和心肌细胞活性的同时，能大幅度提高心肌细胞纯度。

新生大鼠心肌细胞原代培养方法

目的 探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法,更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度的心肌细胞,以建立良好的原代心肌细胞研究模型.方法 无菌状态下取出生3 d以内Wistar乳鼠心室肌,以混合消化酶(0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合液)反复进行短时间多次消化,用差速贴壁法纯化心肌细胞,并加入5-溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖,2 d后首次换液,以后隔日换液.结果 心肌细胞24 h左右已基本贴壁,并可见单个细胞搏动,2～6 d形成单层心肌细胞和其细胞簇的同步搏动,经培养所获细胞搏动良好,存活率高,免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞纯度95%以上.结论 该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法,值得进一步推广.

不同胶原酶消化对原代成骨细胞获得率及活性的比较

目的:比较Ⅰ、Ⅱ型胶原酶对新生大鼠颅盖骨的消化效果,选择效率较高的胶原酶,为日后从细胞水平研究中药治疗骨质疏松症的机制提供大量种子细胞.方法:新生24 h SD大鼠10只,雌雄不限,脱颈处死后取出颅盖骨,剪成约1 mm×1 mm的碎片,采用胰酶预消化15 min后将骨片按重量平分成两等份,随机分为Ⅰ型组、Ⅱ型组,分别用0.1％Ⅰ型、0.1％Ⅱ型胶原酶37℃消化1h×2次,所得细胞置于5％CO2培养箱中37 ℃恒温培养.原代细胞分别于培养0h、72 h时采用血球计数板进行计数,第2代细胞于培养48 h后采用NBT/BCIP染色液进行染色,并通过对硝基苯磷酸盐法(PNPP)进行ALP定量检测.结果:镜下观察所获得的细胞形态不规则,细胞计数显示Ⅰ型组细胞数量大于Ⅱ型组；ALP染色为阳性；PNPP法测得两组吸光度均值分别为0.427和0.262,Ⅰ型组显著高于Ⅱ型组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:两种胶原酶均适用于成骨细胞的原代消化,但采用Ⅰ型胶原酶获得的细胞数量更多、活性更好,可为日后骨质疏松症的机制研究提供优质的种子细胞.

促进脊髓损伤修复的天然药物筛选

目的:从天然药物中筛选促进大脑皮质神经元轴突增长的药物.方法:采用系统溶剂提取法得到不同部位的人参、刺五加、黄芪提取液.从大鼠胚胎(SD大鼠,妊娠17d)的大脑皮质分离神经细胞原代培养；应用磷酸化神经丝H(pNF-H)抗体(轴突的标记)和微管相关蛋白2(MAP2a&2b)抗体(树突的标记)进行免疫染色；采用显微摄影技术及图像分析技术,测量神经细胞轴突和树突的长度.结果:人参醇提液1 mg.L-1可促进大脑皮质神经细胞轴突增长(P＜0.05)；刺五加水提取液1 mg·L-1在大脑皮质神经细胞轴突增长方面有效(P＜0.05)；从剌五加水提取液中再次分得乙酸乙酯、正丁醇和水部分,其中1 mg·L-1正丁醇部位和水部位显示出促进轴突增长的作用(P＜0.05).结论:人参的醇提取液和刺五加的正丁醇部位及水部位可能具有潜在的促进脊髓损伤修复的作用.

人腹膜假黏液瘤原代细胞培养及鉴定

目的 体外培养和扩增腹膜假黏液瘤(PMP)原代细胞,为腹膜假黏液瘤的研究及药物筛选提供基础.方法 用胶原酶消化法分离5例腹膜假黏液瘤样本并进行原代细胞培养,然后用染色体核型分析鉴定培养的细胞是否为肿瘤细胞;再用PAS染色检测细胞中性黏多糖;3D细胞培养模拟肿瘤在体内的状态;HE染色观察3D细胞的组织形态;裸鼠成瘤实验检测原代细胞的致瘤性.结果 PMP细胞原代培养5例均成功;2D培养的细胞贴壁增殖,形态为多边形鹅卵石样排列,可传代到18代;染色体核型分析显示大多数细胞是亚二倍体核型的肿瘤细胞;细胞PAS染色阳性,说明培养的原代细胞内含有黏液;3D培养的类器官与体内肿瘤组织形态相似;裸鼠成瘤率低,且形成的肿瘤与患者PMP相似度不高.结论 PMP原代细胞可在体外培养和扩增.

乳腺癌组织细胞的高效原代培养及其特性

目的：高效扩增乳腺癌组织细胞，明确其特性，为乳腺癌深入研究及个体化治疗提供实验材料。方法利用小鼠胚胎成纤维细胞3T3swiss作饲养层细胞，培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632，对乳腺癌组织细胞进行原代培养。CCK-8检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞周期；免疫细胞化学检测细胞CK分子表达；RT-PCR检测HER-2， ER，PR及乳腺癌干细胞相关标志分子（如CD44，CD24等）mRNA的表达；STR检测以明确细胞身份。结果在饲养层细胞和Y-27632抑制剂同时存在的情况下，所培养的乳腺癌组织细胞增殖速度较快，可短时间获得大量细胞；细胞呈多角形上皮样，CK、HER-2、ER表达阳性，PR 不表达； CD44和CD24表达阳性；经STR分析证明其身份正确。结论饲养层细胞及ROCK抑制剂有助于乳腺癌组织细胞的原代培养及大量扩增，扩增的细胞性质稳定，可用于个体化治疗研究。