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基于16S和23S rDNA基因芯片检测和鉴定七种临床常见病原菌
目的 以细菌16S rDNA和23S rDNA基因为靶序列建立可检测临床七种常见病原菌寡核苷酸芯片系统.方法 采用双重PCR扩增标本中靶细菌16S和23S rDNA基因片段.构建能同时检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7、副溶血性弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌和志贺菌的寡核苷酸芯片,并考核芯片的检测特异性、灵敏度和重复性.采用所建立的寡核苷酸芯片检测81例腹泻患者粪便样本.结果 双重PCR可同时扩增上述七种病原菌的16S和23SrDNA基因靶序列.所研制的寡核苷酸芯片检测灵敏度可达103 cfu/ml,非靶细菌无阳性结果 ,不同批间和批内芯片的变异系数为3.89%～5.81%.寡核苷酸芯片检测粪便样本的阳性率为39.5%(32/81),与常规细菌学检查法检测结果 的符合率达到96.3%(78/81),菌种鉴定结果 符合率为96.8%(31132).结论 研究建立的寡核苷酸芯片法在检测七种病原菌时具有简便、快速、准确、高通量等优点,适合于临床样本检测及流行病学现场调查.
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川芎嗪对培养人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响
目的:研究川芎嗪对培养人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,探讨川芎嗪保护内皮细胞的分子机制.方法:制备包含500个心血管疾病相关基因的寡核苷酸芯片;运用制备的心血管寡核苷酸芯片研究川芎嗪对培养人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响.结果:川芎嗪(40微克/毫升)作用培养内皮细胞24小时后,寡核苷酸芯片分析筛选出川芎嗪对内皮细胞的影响基因25个,其中上调基因7个,下调基因18个,包括一些与免疫、血管舒缩、细胞粘附、凝血、抗氧化、细胞生长、信号转导及物质代谢的相关基因.结论:川芎嗪在基因水平通过多环节调节内皮功能.
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HLA-DRB1-12寡核苷酸芯片的制备及优化
生物芯片技术是基于杂交原理发展而来的,是将固相反应的原理和形式应用于大分子识别反应(核酸杂交、抗原抗体结合或酶促的模板依赖性的连接、延伸等反应)中,以达到对大量的目标分子进行快速、平行的特异识别.寡核苷酸芯片的制备过程中关键部分是基片的表面化学处理和探针末端的不同修饰.为了比较不同末端修饰探针在不同化学处理的载玻片上的杂交信号的强弱,本研究根据HLA-DRB1-12的序列设计8种不同类型的探针,即4种5′末端修饰探针,包括末端氨基修饰探针(N),氨基加四聚乙二醇间隔臂探针(NL),硫代探针(S),硫代加四聚乙二醇间隔臂探针(SL)和4种3′末端修饰探针,同样包括末端氨基修饰探针,氨基加四聚乙二醇间隔臂探针,硫代探针,硫代加四聚乙二醇间隔臂探针.将这8种探针分别固定在溴化芯片和醛基芯片上,与末端标记荧光的不对称的PCR产物进行杂交,通过比较杂交结果荧光信号的强弱,筛选出探针同活化基片的佳组合,从而达到优化寡核苷酸芯片制备的目的.另外,为了进一步比较四聚乙二醇间隔臂对杂交信号的影响,设计末端连接不同数目四聚乙二醇的3′氨基探针.结果显示,3′末端修饰探针杂交信号强于5′末端修饰探针,探针在溴化芯片中的杂交信号强度高于在醛基芯片中杂交信号,3′带有间隔臂的氨基探针在溴化芯片中的杂交信号强.另外3′氨基探针中间隔臂可以增强杂交信号强度,但随着数目的增加,杂交信号并不显著增加.结论:溴化芯片中3′末端带间隔臂的氨基修饰探针在杂交过程中可以更有效的捕获靶标,提高寡核苷酸芯片的杂交能力;四聚乙二醇的数量不必过多使用;通过这种方法可以达到优化芯片制备的目的,为下一步HLA寡核苷酸分型芯片及其他基因芯片的研制提供有效的手段.
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应用寡核苷酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型
为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA系统基因分型的集成化技术平台,在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域,自行设计一套寡核苷酸分型探针;采用本实验室自建的方法,制成寡核苷酸芯片.提取的基因组DNA以组间特异性引物,单侧引物荧光标记,行不对称扩增.杂交后扫描检测分析杂交信号,确定HLA等位基因型;分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测.结果表明:100例样本芯片分型全部成功,其中50例标准DNA与其模板相符,另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符,其中2例分型结果不完全;重复杂交实验中,位点重现率95%.结论:研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片,其准确性和重现性理想,且操作简便、快捷,有广泛的应用前景.
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bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析
为了研究bcr-abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值,设计了融合基因检测探针,制成寡核苷酸芯片;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交,以检测白血病细胞中bcr-abl基因.结果表明:通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr-abl融合基因.结论:应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr-abl融合基因有独特的优势,具有一定的临床应用价值,但也存在一定的不足,若对芯片进一步改进,则今后在血液病方面应用前景是非常广阔的.
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应用多重RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法检测儿童白血病常见融合基因
本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用.采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测.结果表明:此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段.84例白血病患者骨髓标本中,31例(36.90%)具有8种染色体结构畸变产生的融合基因.包括tel/amll、e2a/pbxl、bcr/ablp190、ber/ablp210、mll/af4、amll/eto、pml/rarα、cbfβ/myhll.芯片检测的敏感性及特异性和RT-PCR方法相当.结论:采用多重巢式RT-PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据.此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值.
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SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响
N蛋白位于SARS冠状病毒(SARS-CoV)颗粒的核心,是SARS-CoV的主要结构蛋白之一,它可以与病毒基因组RNA结合.目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1(activator protein 1)信号转导途径;并发现在压力条件下(即缺乏生长因子时),N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组.本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化.通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理,得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱.N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关.
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利用寡核苷酸芯片检测乙型肝炎病毒基因突变
目的利用寡核苷酸芯片平行分析乙肝病毒表面抗原区S、前核心抗原pre-C区、X区、聚合酶P区12个已知的突变位点.方法针对S、pre-C、X、P区的12个突变位点,设计位于乙肝病毒反义链的24条寡核苷酸探针和两对PCR引物,探针长度为14～18bp,其5′端连有氨基己烷和T15间隔子,合成后经点样仪点到醛基化玻片上.两对PCR引物分别用于扩增S与P区内的5个突变位点和X、前C区内的7个突变位点,其中上游引物含有荧光标记.不对称PCR扩增所得到的荧光标记的单链DNA与寡核苷酸阵列杂交、清洗后经扫描分析实验结果.结果在对12个乙肝阳性样品前核心抗原C和X区的突变检测中,存在1762A→T,1764G→A联合突变的有2例、1896G→A突变的3例、同时存在1762A→T、1764G→A联合突变和1896G→A突变的1例、未存在任何突变的样品6例.在12个乙肝阳性样品的表面抗原S的突变检测中,未发现有突变出现.部分样品的随机测序结果与寡核苷酸阵列杂交结果一致.结论寡核苷酸芯片适于快速、平行、大量检测突变.
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HLA-A寡核苷酸芯片检测条件的初步探索
寡核苷酸芯片(Oligochip)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术.寡核苷酸基因芯片的一个主要用途是基因突变的快速和高通量检测.本研究以HLA-A小型阵列为平台,探讨寡核苷酸芯片检测条件(样品制备方法和单链扩增条件)的简化和优化.
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肿瘤相关寡核苷酸芯片筛选乳腺癌表达基因的研究
乳腺癌的发生、发展和治疗具有很强的个体特异性.寡核苷酸芯片是一种高通量基因检测技术[1].目前,该项技术已被用于炎症[2]和细胞分化[3]相关基因等研究领域.本研究制备了288条人类肿瘤相关基因的寡核苷酸芯片,并对乳腺癌组织和正常乳腺黏膜组织所表达的基因进行筛选,同时进行差异表达基因生物信息学分析研究,以揭示这些差异基因与乳腺癌发生、分化、浸润及淋巴结转移之间的内在联系.
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GADD45β在肝癌中的异常表达
目的:探讨生长抑制DNA损伤诱导因子β(GADD45β)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系.方法:应用寡核苷酸基因芯片、反转录PCR(RT-PCR)、免疫组织化学技术检测GADD45β在人正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中的异常表达,分析GADD45β与临床病理学特征的关系及其异常表达的可能分子生物学机制.结果:正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中GADD45β mRNA的阳性表达率分别为80％、60％和26％,肝癌组织与正常肝组织间有非常统计学差异(x2=15.128,P<0.01); GADD45β在肝癌组织中的表达缺失与病理学分级显著相关(P<0.01).结论:GADD45β作为抑癌基因在肝癌的发生发展中起到相当重要的作用,且与肿瘤分化程度密切相关.
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肝癌发生过程中的差异基因表达
目的:应用寡核苷酸芯片研究正常肝脏、慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的基因表达谱,筛选肝癌相关基因.方法:分别对正常肝组织及肝炎、肝硬化和肝癌组织进行总RNA抽提并纯化,反转录得到cDNA,生物素标记cRNA探针,分别与含有19378个已知基因的寡核苷酸芯片进行杂交,Gene Scanner 3000激光系统扫描,GenePix Pro3.0分析软件读取处理杂交信号.结果:在慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌组织中,筛选出共同差异表达基因81个,其中持续上调表达基因53个,持续下调表达基因数28个.结论:寡核苷酸基因表达谱芯片能够快速筛选出肝癌相关基因,有多种基因共同参与肝癌发生的整个过程.
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外源质粒DNA对小鼠肠道基因表达谱的影响
目的:研究外源质粒通过胃肠道途径吸收对小鼠肠道基因表达谱的影响.方法:给Balb/c小鼠灌胃质粒pcDNA3200μg,在灌胃后4 h后分离空肠一段,提取肠组织的总RNA.利用寡核苷酸芯片对灌胃质粒pcDNA3后的Balb/c小鼠肠道进行基因表达谱研究.结果:灌胃外源质粒DNA后,所检测的17667基因中有61条基因产生差异表达,其中36条基因表达上调,25条基因表达下调.这些差异表达的基因主要涉及免疫应答、抗氧化及解毒功能、脂质代谢、阴离子转运蛋白、细胞凋亡及信号转导等过程.结论:外源质粒DNA通过胃肠道途径可广泛调控肠道多种基因表达.
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乙型肝炎病毒B基因型亚型的检测
目的:建立乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)B基因型亚型的检测方法,并对其进行临床研究.方法:根据GenBank中20株Ba亚型,10株Bi亚型以及25株C型全长基因组序列设计Ba、Bj亚型特异探针以及巢式PCR引物.采用反向杂交技术将B亚型特异探针固定在芯片上,通过与地高辛标记的扩增产物杂交检测B型HBV亚型.对镇江地区200例B基因型HBV血清样本进行亚型分析并对患者HBVDNA YMDD变异进行检测.通过对部分血清中的HBV DNA进行序列分析验证该方法的准确性.结果:200例B基因型HBV患者中,Ba亚型184例(92%),Bj亚型16例(8%).在持续使用拉米呋啶的80例患者中,Bj亚型6(0%)例,均无YMDD变异,Ba亚型74例,YMDD变异21(28.4%)例.结论:镇江地区B基因型HBV以Ba亚型为主.Ba、Bj亚型在服用拉米呋啶1年后发生YMDD变异的几率并无统计学上的显著差异.
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胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的制备和初步应用
目的 探讨胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的构建,初步验证其在检测胰腺癌基因表达谱方面的应用. 方法 有目的地筛选胰腺癌相关基因,采用合成后点样的方法,制成寡核苷酸基因芯片.TRIzol法抽提组织总RNA,在cDNA第一链合成过程中,通过反转录酶将CyDye标记核苷酸直接掺入到cDNA中制备荧光探针,其中用Cy3-dCTP标记胰腺癌组织,Cy5-dCTP标记正常胰腺组织.将荧光标记探针与芯片杂交16～18 h.用Agilent扫描仪进行扫描,Imagene3.0软件进行图像分析,计算两种荧光Cy3与Cy5信号强度的比值.挑选差异基因CDC25B和TUSC3进行荧光定量PCR(Sybrgreen方法)验证,PCR产物的定量方法采用比较Ct法. 结果 芯片杂交扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比,各阳性质控点信号均匀一致,阴性质控点和空白点信号低.与正常组织相比,胰腺癌组织中差异表达基因24条,占全部基因的25.5%,其中上调基因17条(18.1%),下调基因7条(7.4%).荧光定量PCR验证,CDC25B和TUSC3基因在胰腺癌中的表达趋势与芯片实验的结果一致. 结论 本研究制备的胰腺癌相关基因芯片可同时、并行检测多种胰腺癌相关基因的表达改变,具有一定的特异性和敏感性.胰腺癌组织与正常胰腺组织相比,基因表达谱具有明显差异.
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HIV检测长寡核苷酸芯片的研制和临床初步应用
目的研制人类免疫缺陷病毒(HIV)快速筛查的寡核苷酸芯片并初步应用于临床.方法以HIV 2个基因型(包括9个亚型)的32株典型性代表株和HIV-2特有的vpx序列的保守序列为靶序列,设计长寡核苷酸探针,并制备成Oligo芯片.样品经随机特异性引物PCR标记后与芯片杂交,PCR产物同时进行测序分析.结果 1例HIV患者芯片杂交结果阳性,20名健康对照血清均为阴性.阳性标本的序列分析表明,芯片杂交结果符合测序的分型结果.结论此芯片可初步用于检测血清HIV RNA,并对HIV基因(亚)型进行分析.
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顺铂诱导肺腺癌A549细胞线粒体基因组及凋亡相关基因的差异表达
目的探讨顺铂诱导肺腺癌A549细胞线粒体基因组及核凋亡相关基因的差异表达情况.方法实验组A549细胞给予0.5μg/ml顺铂作用20h,同时设立空白对照组,用人线粒体基因组寡核苷酸芯片检测26个靶基因的差异表达.用流式细胞技术分析细胞凋亡比例.结果实验组A549细胞的细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(Cox Ⅰ)、12S rRNA以及半胱氨酸转运RNA(tRNA-Cys)、天冬酰胺转运RNA(tRNA-Asn)基因表达显著上调,促凋亡基因bax和另外3个编码多肽基因、4个tRNA基因表达也有一定程度上调.实验组A549细胞凋亡率为8.5%±0.78%,显著高于对照组的1.3%±0.56%(n＝5,P<0.05).结论顺铂诱导能使残存的A549细胞mtDNA编码的部分基因表达增强,并可能通过对bax基因表达的上调促进细胞凋亡.
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应用肿瘤相关寡核苷酸芯片筛选乳癌差异表达基因
目的:应用寡核苷酸芯片技术研究乳癌基因表达谱.方法:根据文献获取目的基因,查询相应基因mRNA序列,通过计算机设计并合成探针,将探针点样于经化学修饰的载玻片上,制备含288种基因的肿瘤相关基因寡核苷酸芯片.提取乳癌与相应正常乳腺组织总RNA,通过逆转录制备荧光标记的cDNA探针并与芯片杂交,经洗片后扫描获取图像,计算机分析比较乳癌组织与正常乳腺组织的差异表达基因.结果:检测16例乳癌组织与正常乳腺组织标本,有10例基因表达存在明显差异,其中表达增高的有6种,表达降低的有4种.结论:乳癌组织与正常乳腺组织存在部分差异表达的基因,乳癌的发生发展与这些基因密切相关;寡核苷酸芯片技术在乳癌相关基因的研究中具有重要意义.
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基于23S rDNA基因的病原细菌通用检测寡核苷酸芯片
目的:利用新兴的生物芯片技术,以细菌23S rDNA基因为靶序列,实现常见病原细菌的通用检测.方法:从核酸数据库中调用一些病原细菌的23S rDNA基因序列,在指定的片段内设计目的细菌的种特异性寡核苷酸探针,用适当的方法固定在玻片上,制备寡核苷酸芯片;扩增实验细菌23S rDNA基因片段,并同时完成荧光素的掺入标记,标记扩增产物纯化后,与芯片进行杂交,根据杂交结果进行条件优化及芯片评价.结果:通过对探针、固定化、标记、杂交等条件进行优化,本实验中所使用的多种实验细菌可以在4h左右通过杂交得到准确鉴定;以奇异变形杆菌为对象,本系统低检出菌液浓度为100个/ml,即反应体系中含10个菌体即可检出.结论:本研究建立的寡核苷酸芯片系统可以稳定而特异地实现多种细菌的通用检测,具有良好的应用前景.
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检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片的研制及应用
目的:探讨用寡核苷酸芯片检测结核分枝杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的可行性.方法:制备了检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片,并且通过优化引物比例和杂交温度以获得佳结果.应用该寡核苷酸芯片检测6例结核分枝杆菌的rpoB基因突变,并与测序结果比较.结果:不同引物比例PCR产物经热变性后杂交,杂交结果无明显差异.杂交温度可以影响杂交结果的特异性和杂交信号的强度.引物比例1∶1,杂交温度50℃为佳条件.6例标本的芯片检测结果显示其中有1例野生型标本,5例突变标本:516位GAC→AAC,GTC,TAC,GAG,531位TCG→TTG.其结果与测序结果完全相符.结论:寡核苷酸芯片可以推广应用到临床作为耐药结核病快速诊断的一种有效方法.
