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丙型肝炎病毒西安株2a型包膜蛋白E区部分cDNA的分析
丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白区（E区）基因是HCV基因组中变异大的部位，不同分离株的核苷酸差异可达40%左右［1］。作者对陕西省HCV地方株的全部E1，部分E2/ NSI区进行了序列测定，并与已发表的多个株做同源性比较。 1.材料和方法：HCV血清取自西京医院丙型肝炎患者，血清经5′非编码区通用引物RT-PCR确认HCV RNA阳性，引物参照HC-J6设计［2］。序列分别为：R1（+）GTGGGTAA-GGTCATCGAT(695～712)，R2（+）GCCGACCTCATGGGGTAC-(731～748)，R3（-）ACCTAGTGCCAACTGCCATTGGT(1 586～1 603)，R4（-）GTTGATGTGCCAACTGCC(1 592～1 609)。 用异硫氢酸胍-冷酚法一步提取HCV RNA，反转录成cDNA，用R1/R4，R2/R3进行套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物纯化、回收，与PGEM-T载体连接，克隆并测序。 2．结果：将所分离毒株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与已报道的HC-J6，HC-J1，BEBE1，HC-J8，HCV-H，HCV-HB，HCV-T的相应序列进行比较。从表1可见，在核苷酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为78.2%，与其他几株的同源性相对要低一些，与中国河北株HCV-HB的同源性低；在氨基酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为75.7%，与其他株的同源性低，与中国河北株HCV-HB的同源性低。 3.讨论：HCV 核酸存在广泛的异质性，其中E区不断发生变异，可能是使病毒在体内持续存在的原因，其变异亦可能与疾病程度、对干扰与治疗的抵抗、引起慢性化及肝细胞癌等有一定相关，赵小宁等［3］已经用RT-PCR法从1例陕西地区丙型肝炎患者血清中扩增并克隆和测定了5′NCR，C区的基因序列，分析同源性为2a型，本次研究用同一份血清，测定了全部E1区，部分E2/NSI区共878 bp的核苷酸序列，将所得序列与已报道的几株HCV序列比较后发现，我们的分离株同HC-J6的同源性大，同属于2a亚型。我国已有完整克隆的河北株、北京株和台湾株，但都属于HCV-1b型，本次对2a型的实验克隆对全面了解HCV基因组的结构及其变异，对HCV的基础及临床研究都具有重要意义。
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新分离的副粘病毒Tianjin株的全基因组序列分析
副粘病毒Tianjin株是一株对普通棉耳狨猴具有高致病性,并可能与人类下呼吸道感染密切相关的毒株.为了明确其基因结构、变异特点及种系进化地位,采用RT PCR、测序和拼接,获得了副粘病毒Tianjin株全基因组序列,与GenBank登录的副粘病毒科7个属和尚未分类的28株病毒及7株仙台病毒代表株,进行同源性比较及系统进化分析.结果表明,副粘病Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒关系近.基因组全长及组成规律与仙台病毒相似,只是L基因末尾A15240C变异而使L蛋白增加了一个谷氨酸残基.副粘病毒Tianjin株存在440个独特的核苷酸变异位点,导致110个氨基酸残基的改变,系统进化上构成独立的分支.副粘病毒Tianjin株在基因组序列、宿主亲嗜性和致病性等方面与已知仙台病毒存在较大的差异,可能代表仙台病毒的一个新基因型.
关键词： 副粘病毒Tianjin株 仙台病毒 同源性比较 系统进化分析 -
猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析
对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析.采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序.经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷酸.与NCBI GenBank登录的国内外参考毒株进行同源性比较及系统进化分析结果表明,GXLC株与GXIO601、GXO602、BJC3、HB1等国内分离株以及CBNU、K3、K11、BEL2887A、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;基于全基因组、结构蛋白及非结构蛋白基因序列绘制的系统进化树拓扑结构图相近,所有EMCV分离株可分成两个群:Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV属于Ⅰa或Ⅰb亚群、鼠源EMCV属于Ⅰa亚群、野猪源EMCV属于Ⅱ群,GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群.
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粪肠球菌sprE基因的功能研究
近有报道在肺炎链球菌发现HtrA(high-temperature requirement A)蛋白,与细菌克服高温、氧化和渗透压力有关.肠球菌原来属于D组链球菌,其许多特性与链球菌相似.肠球菌能否产生HtrA蛋白酶以及确切的功能目前尚不清楚.我们利用BLAST将肺炎链球菌HtrA蛋白酶编码基因与粪肠球菌染色体基因组进行同源性比较,发现粪肠球菌有一个全长为851 bp的开放性读框与肺炎链球菌htrA基因有较高的同源性.进一步从基因文库查找此开放性读框,发现它是编码粪肠球菌假定的丝氨酸蛋白酶基因,被命名为sprE.为了研究sprE基因的确切功能,利用基因敲除构建粪肠球菌sprE基因突变菌株,在不改变该细菌其它遗传性状的基础上,研究sprE基因在粪肠球菌抗高温和氧化作用.
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福建西北林区人单核细胞埃立克体病分子流行病学调查研究
[摘要]目的 了解福建西北林区人单核细胞埃立克体病的存在情况.方法 评价以查菲埃立克体16S rRNA基因序列高变区构建引物进行的半套式PCR的敏感性和特异性,并用此种半套式PCR技术检测从福建武夷山市和宁化县采集的蜱类、野生动物内脏和血液及人群血液标本中的查菲埃立克体DNA,对有代表性的阳性标本的扩增产物进行克隆和序列测定,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较.
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大鼠肝再生相关基因LRRP1的克隆化
目的:利用抑制性消减杂交技术构建大鼠肝脏部分切除术后差异表达基因的cDNA文库,并通过同源引物反转录PCR的方法克隆大鼠肝再生相关基因LRRP1的全长序列.方法:分别提取肝脏部分切除术后24h以及对照大鼠肝脏mRNA,以之为模板合成cDNA,称为测试和驱动.酶切消化后将测试分成两组,分别与不同的接头连接,分别与驱动进行杂交,然后混合两份杂交液,加入过量的驱动不经变性进行第二次杂交即消减杂交.之后进行两次PCR扩增,将产物克隆入质粒载体,构建差显文库,测序后以生物信息学技术进行序列同源性比较.通过同源引物反转录PCR的方法克隆基因全序列,并用软件分析其蛋白结构.结果:成功构建大鼠肝脏部分切除术后的cDNA差显文库,消减效果良好.将所得的部分基因进行测序分析,选择一个未知序列,通过同源引物反转录PCR的方法克隆到大鼠肝再生相关基因LRRP1的全长序列,并初步分析了其蛋白结构.结论:确定了大鼠肝再生相关蛋白LRRP1的基因序列,并证明其在大鼠肝再生过程中高度表达.
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肝癌患者乙型肝炎病毒X基因变异的研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因变异在肝癌发生中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术从5例肝细胞癌患者及12例慢性乙型肝炎患者血清中扩增X基因,然后将纯化的PCR产物进行序列测定,对获得的序列进行变异性及同源性分析.结果:肝细胞癌患者中得到的HBV X基因序列与Genebank中多个已发表的HBV各血清亚型序列进行同源性比较,发现核苷酸同源性在89-96%之间,血清亚型以adw为主.与非肝癌组的比较发现X基因序列的替换突变中存在4种形式.6个位点的变异仅出现于肝癌组,12个热点变异多见于肝癌组而少见于非肝癌组.结论:X基因序列的突变与肝细胞癌的发生有关.
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肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
目的:克隆原发性肝癌相关新基因.方法:利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST),长447 bp,经Genebank检索,90%无同源性.在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2:5'-CGCATAGTACCAGTATCGAC AAAGG-3',3'NGSP2:5'-TCCACATTACGGACC CGACGGATT-3'),利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列.人原发性肝癌细胞株HepG2,体外传代培养,培养基为RPMI1640培养基.提取HepG2总RNA,方法参照SV Total RNAIsolation System 的说明进行.RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit.将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收,然后将其克隆到PMD18-T Vector中,提纯质粒后进行酶切鉴定,确认质粒内有插入片段,由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序,将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank与dbEST、 nr数据库进行同源性比较,确认代表新基因的EST并且登录GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.GOV/submission).3便病理标本取自西南医院肝胆科,病理证实均为原发性肝细胞肝癌,分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA.将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针,利用Clontech公司的 ExpressHYBTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达,方法参照ExpressHYBTM Hybridization Solution user manual说明进行.同时,利用一联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE(series analysis of gene expression,SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析,从而确定其组织分布.结果:得到5条3'EST(694 447-3,724 447-3,697 447-3,711 447-3 692 447-3;大小500-550bp),5条3'EST均为登录GenBank(登录号:CK730344,CK730345,CK730346,CK730347,CK730348).对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3 724 447-3)进行序列分析后,发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列.RNA印记分析显示694 447-3,724 447-3在3例肝癌组织中的表害强度时显高于对应的正常组织.通过SAGE文库分析基因的表达谱,发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的政党组织文库.结论:克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多期因家庭成员.利用RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.
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HIV耐药性检测方法及其临床应用
艾滋病病毒(HIV)是一个极其多样化的"准种"群体,通过对不同HIV株env、gag基因的同源性比较与系统学分析,证实了M、O、N演化群的存在,并在M群内划分出若干个"丛"(cluster)或"簇"(clade),即基因亚型,分别用A、B、C、D...表示,原有欧美株被归入B亚型.
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288株猪圆环病毒的序列比较及遗传进化分析
目的 为进一步了解猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的遗传进化规律,为该病的预防和控制奠定基础.方法 对来自世界各国的26株PCV1和262株PCV2的全序列用生物软件进行了核苷酸的同源性比较,并对其ORF1和ORF2进行了核苷酸和推导氨基酸的比较.结果 从核苷酸水平来看,PCV1与PCV2明显分为两支,PCV1间分布没有规律,而PCV2间又分为以来自美国、加拿大、澳大利亚的序列为代表的亚型Ⅰ和以来自法国和新西兰的序列为代表的亚型Ⅱ;但从氨基酸水平来看,其分型并没有规律可循.从遗传进化树可以看出,PCV2的分布并没有地域性和时限性.数据统计显示,尽管相隔近十年之久,但其同源性并没有发生太大的改变,可见PCV2相当保守.另外对PCV2的碱基和氨基酸突变位点进行统计发现,PCV2序列间更倾向于碱基的颠换,但并无单个碱基和氨基酸的偏好性.结论 PCV2相对保守,地域性和时限性分布不明显.
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恶性疟原虫FCCl/HN株exp-1基因的克隆及序列分析
分泌蛋白1(exported protem l,exp-1)又称环子孢子相关抗原[1].QF116抗原[2]或抗原5.1[3],是23 kDa的恶性疟原虫红内期抗原.在肝期的晚期也有表达[4].exp-1由疟原虫表面分泌.定位到纳虫空泡和感染的红细胞内的膜结构上[5]本文克隆、测定、分析了恶性疟原虫海南株(FCCl/HN)exp-l基因序列,并对FCCl/HN与国外的3D7[5]、Kl6、FC27[1]、FCR3(GenBank Accession No.AF061080)株exp-l基因编码的氨基酸残基序列进行同源性比较.
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广州地区婴幼儿感染Noro病毒基因型的初步研究
目的 探讨广州地区婴幼儿腹泻中感染Noro病毒的基因型.方法 用Clustal W比对GⅡ组Noro病毒后,设计处于ORF 1与ORF 2连接点两旁两对简并引物,进行巢式RT-PCR扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列,对ORF1与ORF 2连接点两旁序列和衣壳蛋白N/S区用Clustal W进行同源性分析,用phylip 3.65软件、邻接法构建进化树.结果 标本NVgz100、NVgz10成功扩增出ORF 1与ORF 2连接点两旁1 208 bp片段(相对于Hawaii virus,U07611位置为4476-5683),包含ORF 1的3′端RdRp的大部分基因和ORF 2基因的5′端的S区.对标本NVgz100、NVgz10与另一实验NVgz01(DQ369797)的1 208 bp进行同源性分析发现,3份标本与G Ⅰ组同源性为58%～61%,与GⅡ组同源性为74%～92%;将这3份标本与G Ⅰ、GⅡ组构建进化树,可发现NVgz100、NVgz10和NVgz01与GⅡ组Bristol等病毒密切相关,将NVgz100、NVgz10和NVgz01的衣壳蛋白N/S区与GⅡ组各基因型进行同源性比较,发现3份标本与GⅡ-4基因型Camberwell、Bristoh Grimsby同源性较高(92%～96%),与其他基因型同源性为70%～73%,以N/S区构建进化树可发现3份标本与Camberwell、Bristol、Grimsby、Lordsdale处于同一簇中.结论 本实验结果表明Noro病毒株以GⅡ组为主,病毒流行的基因型为与Camberwell、Bristol、Grimsby和Lordsdale等密切相关的GⅡ-4基因型.F
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淋球菌性菌血症的快速筛查及鉴定
目的探讨16S rDNA检测技术在快速筛查鉴定淋球菌性菌血症中的应用价值.方法选择1例反复规律性发热、畏寒1个月入院的41岁男性菌血症患者,入院前几天开始出现尿急、尿频和尿痛症状,大便正常,贫血消瘦外容,皮肤黏膜稍苍白,无出血点及皮疹,全身浅表淋巴结未及肿大,血尿常规异常,肝肾功能尚可.采用PCR检测菌血症患者外周血病原菌16S rDNA,对其扩增产物进行DNA测序,再将DNA序列结果与GenBank中的已知序列进行同源性比较;同时对外周血病原菌进行分离培养鉴定及药敏实验.结果16S rDNA扩增产物序列与GenBank中的已知序列进行同源性比较后确定为淋病奈瑟菌,同外周血分离培养鉴定结果一致.结论检测淋球菌性菌血症患者外周血16S rDNA具有高效率、高特异性、高灵敏度、快速准确等特点.
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豫医卷毛大鼠无毛基因cDNA序列的比较生物学分析
目的:对豫医卷毛大鼠的无毛(Hr)基因进行比较生物学分析.方法:采用PCR方法对豫医卷毛大鼠Hr基因的cDNA序列进行克隆、测序,并与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的Hr基因cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析.结果:获得了豫医卷毛大鼠Hr基因全长5 232 bp的cDNA序列(GenBank登录号:KR109217).豫医卷毛大鼠Hr cDNA与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的同源性分别为99.8％、87.3％、67.3％、70.2％、80.8％、79.8％、29.8％和24.9％,氨基酸序列的同源性分别为100.0％、92.9％、75.4％、74.8％、76.0％、77.8％、7.4％和11.7％.结论:Hr基因在哺乳动物中具有一定的保守性,与昆虫等非哺乳类动物之间具有较大的差异性.
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豫医卷毛大鼠 Krt71基因 cDNA序列的比较生物学分析
目的：对豫医卷毛大鼠的Krt71基因进行比较生物学分析。方法：采用PCR方法对豫医卷毛大鼠Krt71的cDNA序列进行克隆、测序，并与BN大鼠、小家鼠、家牛、家绵羊、家猫、苏门答腊猩猩和人的Krt71 cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果：获得了豫医卷毛大鼠Krt71基因全长1573 bp的cDNA序列（ GenBank登录号：KF303588）。豫医卷毛大鼠与BN大鼠、小家鼠、家牛、家绵羊、家猫、苏门答腊猩猩和人的同源性分别为99．9％、95．2％、88．5％、87．5％、88．0％、88．1％、88．1％，氨基酸序列的同源性分别为99．9％、98．9％、92．4％、91．2％、91．4％、92．3％、92．1％。结论：Krt71基因在哺乳动物进化过程中具有较高的保守性，是一个具有重要功能的“持家基因”。
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豫医卷毛大鼠转化生长因子α基因的比较生物学分析
目的：对豫医卷毛大鼠的转化生长因子α（ TGFα）基因进行比较生物学分析。方法：采用PCR方法对豫医卷毛大鼠TGFα的cDNA序列进行克隆、测序，并与BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的TGFαcDNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果：获得了豫医卷毛大鼠TGFα基因全长970 bp的cDNA序列（ GenBank登录号：KF366251）。豫医卷毛大鼠与BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的同源性分别为98．6％、95．0％、85．5％、85．3％、85．5％、86．3％、86．3％、73．2％、73．2％和56．8％，氨基酸序列的同源性分别为98．8％、96．9％、90．6％、90．6％、91．2％、91．9％、91．9％、72．6％、72．6％和38．8％。结论：TGFα基因在进化过程中具有较高的保守性，但不同物种之间也具有功能上的特异性。
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豫医卷毛大鼠表皮生长因子基因的比较生物学分析
目的：对豫医卷毛大鼠的表皮生长因子（ EGF）基因进行比较生物学分析。方法：采用PCR方法对豫医卷毛大鼠EGF基因cDNA序列进行克隆测序，并与BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴和人EGF基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果：获得了豫医卷毛大鼠EGF基因全长3522 bp的cDNA序列（ GenBank登录号：JX437943）。豫医卷毛大鼠EGF基因编码区的核苷酸序列与BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴和人的同源性分别为97．8％、83．4％、59．7％、76．5％、73．5％，其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为99．3％、79．9％、52．9％、69．6％、69．4％。结论：EGF基因在进化过程中具有一定的保守性，但不同物种之间也具有特异性。
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豫医卷毛大鼠表皮生长因子受体基因的比较生物学分析
目的:比较豫医卷毛大鼠与其他物种间表皮生长因子受体(EGFR)基因及其编码蛋白的序列差异.方法:采用RT-PCR方法对豫医卷毛大鼠EGFR cDNA序列进行克隆、测序,并借助生物信息技术对BN大鼠、家鼠、黄牛、猕猴和人EGFR基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析.结果:获得了豫医卷毛大鼠EGFR基因全长4 127 bp的cDNA序列(GenBank登录号:HM801041).豫医卷毛大鼠与大鼠、小鼠、牛、猴和人等5个物种EGFR基因编码区的核苷酸序列同源性分别为99.5%、93.1%、81.6%、83.3%和83.6%,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别是99.8%、96.1%、87.4%、89.2%和90.9%.结论:EGFR基因在进化过程中是一个高度保守并具有重要功能的"持家基因".
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小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠杆菌中的表达
根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38～40位碱基,终止密码位于779～781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2.9178×104道尔顿.与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%.构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达.
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对虾白斑综合征杆状病毒同源性比较的研究
比较我国沿海不同海域对虾白斑综合征杆状病毒三个分离株：即唐海 分离株（渤海湾），宁波分离株（东海），深圳分离株（南海）的同源性。三个WSSV分离株 基因组的限制性内切酶(SacI，HindIII，PstI) 酶切多态（RFLP）以及 病毒结构蛋白图谱完全一致，证实造成我国从南至北对虾爆发性流行病的对虾白斑杆状病毒 为同一种病毒。利用高保真Taq酶，分别以报道的日本对虾杆状病毒（RV-PJ＝PRDV），斑节 对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV＝PmNOBIII）基因组核酸片段特异性引物进行PCR扩增，结 果均能从中国对虾白斑杆状病毒（WSSV）基因组中扩增得到相应大小的PCR产物，扩增产物 序列分析表明中国对虾白斑杆状病毒（WSSV）与斑节对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV＝PmNO BIII），日本对虾杆状病毒（RV－PJ＝PRDV）同源率分别为100％与97％，其结果为证实亚 洲及太平洋地区对虾白斑综合征杆状病毒为同一种病毒或同一种病毒的不同株系提供了证据。
关键词： 对虾白斑综合征杆状病毒(WSSV) PCR 同源性比较
