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双酚A对小鼠胚胎干细胞OCT4及SOX2基因表达的影响
目的 探讨双酚A(bisphenol A,BPA)对小鼠胚胎干细胞(mESC)的毒性特征及OCT4、SOX2基因表达的影响.方法 分别以10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的BPA及二甲亚砜(溶剂对照组,DMSO)处理mESC系(S6)细胞24 h,重复处理3次,倒置显微镜下观察正常组、染毒组细胞的形态变化,CCK-8法检测BPA对细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50)；分别采用real-time (RT)-Q-PCR和western-blotting技术检测BPA作用下OCT4、SOX2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化.结果 BPA对mESC有一定的毒性作用,染毒浓度越大,细胞活性越小,二者呈剂量-效应关系,并通过计算得出BPA对mESC的IC50为4.3×10-4mol/L,同时结合BPA的环境相关暴露浓度和相关资料,终取10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L系列浓度作为后续实验浓度；BPA处理24 h后,mESC细胞形态发生改变,较高浓度组与对照组比较,细胞数量明显减少,出现少许漂浮的细胞,克隆变得不规则,分化趋势明显.BPA浓度为10-7、10-6、10-5、10-4的OCT4mRNA相对表达量分别为1.146 ±0.087、1.156 ±0.030、1.158±0.103、1.374±0.053,均高于对照组(1.000±0.000)(t值分别为-2.384、-2.953、-3.203、-4.021,P值均＜0.05)；BPA染毒浓度为10-4 mol/L(1.113±0.052)的SOX2 mRNA相对表达水平高于对照组(1.000 ±0.000)(t=-2.765,P＜0.05).染毒浓度为10-5、10-4 mol/L的OCT4蛋白质相对表达量分别为1.360±0.168、1.602±0.151,均高于DMSO组(1.000 ±0.000),差异有统计学意义(t值分别为-3.538、-4.002,P值均＜0.05)；而各浓度组SOX2蛋白相对表达水平差异无统计学意义.结论 BPA对mESC具有一定的细胞毒性,在一定剂量范围内BPA可以使mESC OCT4基因表达增加,而对SOX2基因无明显影响.
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纤维支气管镜活检组织Sox2基因对肺癌的诊断价值
目的：探讨纤维支气管镜活检组织标本中干细胞标志物Sox2 mRNA对肺癌的诊断价值。方法采用RT-PCR技术检测100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纤维支气管镜活检标本中Sox2 mRNA的表达，随后利用免疫组化技术验证Sox2蛋白在50例肺癌组织、32例良性病变肺组织和18例癌旁正常肺组织间表达的差异，分析Sox2 mRNA表达与肺癌临床病理参数的关系及其在肺癌诊断中的潜在价值。结果 Sox2 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达量显著高于非癌肺组织（P＜0.05）。肺癌患者不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移，Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义。Sox2 mRNA ROC曲线下面积为0.748，临界值取0.513时，其灵敏度和特异度分别为85.0%和61.1%。结论纤维支气管镜活检组织标本Sox2 mRNA可能是肺癌诊断的有效标志物。
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巢蛋白对缺血心肌损伤再修复影响
目的:探讨巢蛋白对心肌梗死后大鼠缺血心肌再修复的影响.方法:将雄性Sprague-Dawley大鼠30只随机分为对照组、心肌梗死损伤组及心肌梗死损伤修复组,每组各10只;心脏超声检测左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(FS).HE染色光镜下观察大鼠心肌形态学改变.Western检测心肌细胞巢蛋白、NKX2.5、GATA4表达.结果:心梗损伤组和心梗修复组均可见心肌细胞肥大,心梗损伤组还出现部分心肌细胞坏死,与心梗损伤组相比,心梗修复组大鼠心肌病理形态、左室大小、射血分数明显改善,巢蛋白、NKX2.5、GATA4表达明显增加(P＜0.01).结论:心肌发生缺血损伤后巢蛋白的表达会增加,巢蛋白参与了损伤心肌的再修复,对损伤心肌具有修复作用.
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Sox2- R9- EGFP融合蛋白的表达及穿膜能力鉴定
构建、表达、纯化、鉴定Sox2- R9 - EGFP融合蛋白,验证其在体外培养的成纤维细胞中的转导活性.以胎猪原始生殖嵴为材料提取总RNA,反转录成cDNA第一链,设计带9聚精氨酸(R9)的特定引物,从cDNA中扩增出猪Sox2基因,克隆到pET- 28a- EGFP载体中,经酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,Ni2+柱亲和层析纯化和SDS- PAGE检测表达产物后,将Sox2- R9 - EGFP蛋白作用于体外培养的猪胎儿成纤维细胞中以观察其转导活性.成功构建Sox2- R9 - EGFP融合蛋白原核表达载体,纯化后蛋白经SDS- PAGE检测证实融合蛋白片段大小正确,加到培养的猪胎儿成纤维细胞中可观察到Sox2-R9-EGFP融合蛋白能进入细胞,且部分可定位于细胞核.获得了Sox2- R9 - EGFP原核蛋白表达栽体,R9能介导Sox2蛋白进入细胞,为进一步利用重组蛋白建立诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS细胞)的研究奠定了基础.
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干细胞转录因子Sox2、Oct4在肺癌组织中表达及与肿瘤微淋巴管的关系
目的 观察干细胞转录因子Sox2、Oct4在肺癌组织中的表达变化,并探讨二者与肿瘤微淋巴管的关系.方法 用免疫组化法检测60例肺癌组织及其相应正常肺组织中Sox2、Oct4蛋白表达、D-240标记的微淋巴管密度(LMVD).结果 肺癌组织中Sox2、Oct4蛋白阳性表达率、LMVD与正常肺组织比较,P均<0.05.Sox2、Oct4蛋白阳性表达及LMVD均与肿瘤分化程度、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移、肝转移有关(P均<0.05),此外Sox2、Oct4蛋白阳性表达还与肿瘤病理类型有关(P均<0.05).肺癌组织中Sox2、Oct4蛋白阳性表达者LMVD与阴性者比较,P均<0.05.结论 Sox2、Oct4在肺癌组织中呈现高表达,二者可能共同参与了肺癌组织微淋巴管的生成、浸润及淋巴道转移.
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SOX2在卵巢癌中的表达变化及其对细胞增殖与侵袭的影响
目的 观察SOX2在卵巢癌组织及细胞中的表达变化,并探讨下调SOX2对卵巢癌细胞增殖与侵袭的影响.方法 收集手术切除的58例卵巢癌组织与癌旁正常卵巢组织,采用real-time PCR检测SOX2 mRNA表达,分析SOX2在卵巢癌组织中的表达与临床病理参数的关系.培养人卵巢癌细胞株SKOV3细胞与人正常卵巢上皮细胞株IOSE80细胞,采用real-time PCR检测SOX2表达.培养卵巢癌SKOV3细胞,将SKOV3细胞分为观察组与对照组,观察组转染si-SOX2,对照组转染si-control,采用免疫印迹试验检测各组细胞SOX2蛋白的表达,采用MTT、Transwell侵袭实验检测各组细胞增殖与侵袭能力.结果 SOX2 mRNA在卵巢癌组织的表达高于癌旁正常卵巢组织,在卵巢癌细胞中的表达高于正常卵巢上皮细胞(P均<0.05).SOX2的表达与卵巢癌患者的高级别FIGO分期、组织学分级以及淋巴结转移有关(P均<0.05).观察组SOX2蛋白表达低于对照组(P<0.01).观察组细胞增殖能力、穿膜细胞数低于对照组(P均<0.05).结论 SOX2在卵巢癌组织及细胞中表达上调,与肿瘤发生发展有关,下调卵巢癌细胞中的SOX2可抑制细胞增殖与侵袭.
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中国汉族人群SOX2基因与高度近视的关联研究
目的 研究SOX2是否可作为中国汉族人群高度近视的候选基因,寻找与高度近视关联的致病基因位点.方法 采用病例-对照关联分析法.将同意参加本研究的83例(160眼)正视者作为对照组,117例(211眼)高度近视患者作为病例组,所有患者均进行详细的眼部检查,并提取外周血白细胞基因组DNA.在中国汉族北京居民的基因型数据库中选取3个标签单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,采用SNP直接测序法进行基因分型检测.根据所有样本所得各标签SNP的基因型,计算其基因型和等位基因频率,并使用Bonferroni法进行多重检验矫正;采用x2检验比较病例组和对照组之间等位基因频率及基因型频率分布是否有差异.结果 3个标签SNP位点(rs11915160、rs4575941、rs4459940)的基因型结果在病例组和对照组中都符合Hardy-Weinberg平衡,本研究人群具有一定的代表性.rs4575941位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组间的差异均具有统计学意义(P=0.04、0.03),但经Bonferroni法矫正后,两组等位基因频率差异无统计学意义(Pc=0.09);病例组rs4575941位点的等位基因G的频率明显高于对照组,OR值为1.58,等位基因G可能是高度近视的一个危险基因.结论 中国汉族人群SOX2基因SNP位点rs4575941与高度近视之间的关联存在可疑性,为了明确相关性,需要进一步扩大样本量,选择合适的多重检验方法,并结合其他手段进行大数据分析.
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SOX2基因在胶质瘤中的表达及生物学作用
目的 探讨SOX2基因在人胶质瘤中的表达水平、甲基化状态以及生物学作用.方法 选取人胶质瘤组织标本108例,正常脑组织30例.采用PCR的方法检测SOX2基因的表达水平和甲基化状态.MTT和软琼脂集落形成试验检测SOX2对胶质瘤U87和U251细胞的生物学作用.结果 SOX2在正常脑组织中的相对表达水平明显低于胶质瘤组织(P＜0.01).SOX2基因启动子区非甲基化比率在胶质瘤中分别为:Ⅰ级23.5％(4/17),Ⅱ级34.8％ (8/23),Ⅲ级51.4％(19/37),Ⅳ级64.5％(20/31),高级别组(57.4％)与低级别组(30.0％)相比具有统计学差异(P＜0.01).过量表达SOX2基因可促进胶质瘤U87和U251细胞增殖和集落形成能力.结论 SOX2基因在胶质瘤组织高表达,其在胶质瘤中的表达水平可能受启动子区域甲基化状态影响,SOX2基因影响胶质瘤的肿瘤学特性.
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应用引物原位标记技术快速检测SOX2基因
目的 应用引物原位标记(primed in situ labeling,PRINS)代替荧光原位杂交技术对SOX2基因进行快速检测.方法 常规制备人外周血染色体并制片,利用SOX2基因特异性引物在染色体上原位扩增包含生物素标记的探针.用酪胺信号放大(tyramide signal amplification,TSA)生物素系统处理经标记的探针.后用链霉亲和素-德克萨斯红(streptavidin-Texas red)对生物素信号进行荧光染色,用DAPI染料对染色体进行复染.作为对照,MCF-10F细胞用慢病毒载体转染导人SOX2基因,使用相同的方法检测结合位点.结果 VideoTesT-FISH软件分析提示,实验组3号染色体长臂端有特异红色荧光信号表达,空白组与未经TSA信号处理的对照组则无特异性的红色荧光信号.经过转染的MCF-10F细胞则表现出不同的SOX2基因整合效果.结论 PRINS技术利用高敏感度的原位PCR技术(in situ PCR)结合荧光标记的脱氧核苷酸可在细胞内原位合成形成探针,可大大减少探针的费用与检测的时间,提高检测效率.在诱导多能干细胞的鉴定与分类中具有较为广泛的应用前景.
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Sox2对宫颈鳞癌细胞增殖能力影响的研究
目的 探讨干细胞转录因子Sox2对宫颈鳞癌细胞增殖能力的影响及其机制.方法 将质粒pIRES-EGFP-Sox2转染宫颈鳞癌SiHa细胞系,采用G418筛选构建稳定表达Sox2的SiHa细胞克隆(SiHa-Sox2),MTT法检测Sox2表达对宫颈鳞癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞周期相关蛋白CyclinD1表达变化.结果 pIRES-EGFPSox2转染SiHa细胞后(SiHa-Sox2组),细胞Sox2基因和蛋白均高表达(P均＜0.01);SiHa-Sox2组细胞增殖速度加快;细胞周期中S期细胞比例明显增加;Western blot检测CyclinD1表达上调(P＜0.05).结论 Sox2基因通过上调CyclinD1蛋白的表达加速细胞周期进程,促进宫颈鳞癌细胞的增殖,从而促进宫颈鳞癌的发生发展.
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沉默干细胞转录因子Sox2对宫颈癌细胞增殖能力影响的研究
目的 探讨沉默干细胞转录因子Sox2对宫颈癌细胞增殖能力的影响及其机制.方法 将干扰质粒(shRNA-Sox2)转染宫颈癌C33A细胞系,利用嘌呤霉素筛选出稳定沉默Sox2表达的C33A细胞克隆株(shRNA-Sox2-C33A).MTT、克隆形成实验检测沉默Sox2表达对宫颈癌细胞增殖能力的影响;流式细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞周期素CyclinD1的表达变化.结果 shRNA-Sox2转染C33A细胞后,细胞中Sox2 mRNA表达下调(t=7.94,P<0.01).干扰组细胞(shRNA-Sox2-C33A)增殖速度低(t=10.93,P<0.05),体外克隆形成率显著下降(t=8.30,P<0.01);细胞周期中G0/G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少(t值分别为-4.60、4.67,均P<0.05);Western blot检测CyclinD1表达下调(t=113.79,P<0.05).结论 沉默Sox2基因表达可能通过下调CyclinD1来阻滞细胞从G1期细胞进入S期,抑制宫颈癌细胞增殖.
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鼻咽癌中SOX2基因的表达研究
目的:研究干细胞表面标志物SOX2基因在鼻咽癌中的表达,探讨对鼻咽癌诊断及治疗的潜在意义.方法:应用PCR及荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测33例鼻咽癌和21例鼻咽炎组织中SOX2基因的表达.以鼻咽炎组作为参照,对两组荧光定量PCR数值△Ct差异进行t检验,应用Li-vak( 2-△ΔCt)法进行相对定量分析,计算鼻咽癌中SOX2基因的表达水平.结果:78.8％( 26/33)鼻咽癌和38.1％ (8/21)鼻咽炎组织中存在SOX2基因的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05).鼻咽癌中57.6％( 19/33)的SOX2基因表达水平比炎症组高,差异具有统计学意义(P＜0.05),21.2％ (7/33)鼻咽癌组织中SOX2基因表达水平比对照组低,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:鼻咽癌组中SOX2基因处于一个较高的表达水平,提示SOX2基因在鼻咽癌中出现了异常表达,是鼻咽癌肿瘤干细胞存在的一个间接证据,为从肿瘤干细胞水平上的诊断及治疗提供一个潜在的靶点.
