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基于ITS2条形码的中药材威灵仙与其易混伪品的鉴定
目的 对中药材威灵仙及其易混伪品进行分子鉴定,为控制药材质量稳定和指导临床合理用药提供科学依据.方法 以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对威灵仙基源植物及其易混品间的种内,种间序列差异进行分析比较,并构建NJ(邻接)树.通过Schultz等建立的ITS2数据库图及其网站预测ITS2二级结构.结果 威灵仙基源植物ITS2序列长度分别为220 bp和230 bp,由所构建的NJ树图可以看出,威灵仙、棉团铁线莲、东北铁线莲聚在一起,支持率达83%;由三种植物的枝长来看,支持了铁线莲属的分布中心在中国云南、四川等西南地区,以中心向四周散布的论点.比较威灵仙及其易混伪品的二级结构发现,威灵仙的正品来源与其它物种在螺旋区茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面具有较明显区别.结论 ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区别威灵仙药材的基源植物与其易混伪品,具有重要的应用价值.
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基于ITS2序列鉴定苗药金铁锁及其混伪品
目的：本研究利用ITS2序列对苗药金铁锁及其混伪品进行鉴定研究，从而确保药材质量，保障临床用药安全。方法：提取金铁锁药材及其混伪品基因组DNA，PCR扩增并双向测序获得ITS2序列。所有序列经过CodonCode Aligner V3.7.1拼接后，采用MEGA5.1软件进行序列比对，计算种内和种间Kimura 2-Parameter（K2P）遗传距离，并构建系统发育树。采用相似性搜索法、近距离法、邻接（NJ）树法对ITS2序列鉴定能力进行评估。结果：金铁锁药材的ITS2序列长度为229 bp ，其ITS2序列种内大K2P遗传距离小于与混伪品的小种间K2P遗传距离；应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定金铁锁药材及其混伪品；基于ITS2序列构建NJ树，金铁锁及其混伪品均表现出良好单系性，均能明显区分。结论：ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金铁锁药材及其混伪品，DNA条形码技术可为金铁锁药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。
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沉香DNA提取方法及种质资源聚类分析研究
目的:分别建立适用于提取不同类型沉香样品(叶片、干燥枝条、药材)DNA的方法,通过ITS2序列对沉香药材进行种质资源聚类分析.方法:根据沉香叶片、干燥枝条、药材的组织差异,分别采用试剂盒法和优化的CTAB法提取DNA;利用紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及ITS2序列测定来检测DNA的纯度、浓度及可用性,以比较不同DNA提取方法的效率;将样品测序结果与从GenBank下载的沉香属(Aquilaria spp.)、拟沉香属(Gyrinops spp.),及沉香药材常见混伪品的ITS2序列,进行聚类分析.结果:优化的CTAB法提取得到的DNA纯度比试剂盒法稍低,但浓度更高.两种方法所提沉香总DNA进行ITS2序列的PCR扩增成功率和测序成功率均为100％.ITS2序列能准确鉴别出4个沉香混伪品和2个拟沉香物种,且15个沉香样品ITS2序列与Aquilaria subintegra(泰国)、Aquilaria sinensis(中国)、Aquilaria crassna(柬埔寨、泰国)三个沉香物种均100％相似.结论:本研究中的两种DNA提取方法均可用于沉香DNA条形码研究;优化CTAB法比试剂盒法更适用于药材DNA的提取,该方法为有关中药材DNA的提取提供了参考;ITS2序列可为沉香种质资源的鉴定和系统发育分析提供必要的实验依据.
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基于中药材DNA条形码系统的泽泻种子鉴别研究
目的:以泽泻种子为研究对象,利用中药材DNA条形码鉴定系统区分不同产地泽泻的基原物种.方法:采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA,扩增核内部转录间隔区ITS2序列并进行测序.利用软件CodonCode Aligner 6.0.2和MEGA 5.1对序列进行拼接,并用体式显微镜观察记录种子外观形态特征.结果:泽泻Alisma plantago-aquatica和东方泽泻Alisma orientale种子外观形态相似;两个物种的ITS2序列长度均为311 bp,GC含量为56.9％,ITS2序列在165 bp处存在T-A变异.该鉴定结果显示,20份四川产泽泻种子样本序列为泽泻A.plantago-aquatica,其他产区36份样本均为东方泽泻A.orientale.结论:中药材DNA条形码鉴定系统可为选择正确基原的泽泻种质提供指导,该系统在泽泻人工栽培生产中具有重要应用价值,可为其他中药材种子鉴定提供示范.
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白头翁属药用植物及药材鉴别研究
目的:本研究对白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3种药用植物及药材进行了形态分类和ITS2序列分子鉴别研究,为建立其分子鉴定方法提供有力依据.方法:通过对长白山区白头翁属3种药用植物进行野外实地考察采样,形态分类描述及提取样品总DNA,扩增ITS2序列、双向测序.所得序列经CodonCode Aligner拼接、比对,采用MEGA 6.0软件对样品进行变异位点分析、计算种内和种间遗传距离(K2P)并构建邻接树(NJ).结果:形态鉴别容易区分白头翁与朝鲜白头翁和兴安白头翁,但朝鲜白头翁和兴安白头翁不易区分,ITS2序列片段长度均为219 bp,3种药用植物的药材ITS2序列与其基原植物序列一致,种间变异位点有6个,遗传距离显示物种种内大K2P距离远远小于种间小K2P距离,NJ树结果显示,白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁均可明显区分.结论:ITS2序列能够准确鉴定白头翁属3种药用植物的药材和基原植物,可作为形态鉴别的有力补充.
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新疆4种绢蒿属植物及近缘种银蒿的ITS/ITS2条形码鉴定研究
目的:评价ITS/ITS2热点条形码序列对新疆4种绢蒿属植物及其近缘种银蒿的鉴别能力,为绢蒿属植物分类鉴定提供分子参考依据.方法:对15份绢蒿属及银蒿植物样本进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,采用CodonCode Aligner软件对序列峰图进行校对拼接,MEGA6.0分析序列碱基组成及变异,计算K2P遗传距离并构建聚类邻接树,预测ITS2序列二级结构,评估鉴别能力.结果:西北绢蒿、针裂叶绢蒿种内变异位点及信息位点数均小于银蒿.ITS序列种间、种内遗传变异均大于ITS2序列.ITS/ITS2序列邻接(NJ)树均聚为3支,绢蒿属、银蒿1、银蒿2.绢蒿属ITS2序列二级结构与银蒿有差异.结论:通过ITS/ITS2序列的种间K2P遗传距离、邻接树、ITS2序列二级结构分析,ITS、ITS2序列具很好的属鉴定效果,不同产地的针裂叶绢蒿被区分开.
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应用DNA条形码技术鉴定中药材酸枣仁
目的:利用DNA条形码鉴定技术对中药材酸枣仁及其混伪品进行分子鉴定.方法:对研究材料进行DNA提取、PCR扩增和双向测序,利用CodonCode Aligner拼接后,将所得序列转换为彩色条形码图片及二维DNA条形码.用软件MEGA进行遗传距离分析,构建NJ(邻接)树.结果:酸枣仁基原植物酸枣的ITS2序列种内遗传距离为0-0.009,远小于其与混伪品的种间遗传距离(0.084-0.190);由所构建的NJ树可以看出,酸枣不同来源的样本聚在一起,表现出单系性.结论:ITS2条形码能够有效地鉴别酸枣仁药材与其混伪品,为保障其用药安全提供新的技术手段.同时,专属二维DNA条形码可以跨平台快速获取酸枣仁的DNA条形码信息,实现对该药材市场流通的数字化监控.
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Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究
目的:采用高分辨率熔解曲线技术(HRM),应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段.方法:收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列.在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品.结果:通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参.进而将其PCR产物测序,以验证该结果.结论:Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测.
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基于ITS2条形码序列鉴定中药材两头尖及其混伪品
目的：本研究利用ITS2序列对中药材两头尖及其混伪品进行DNA条形码鉴定，以确保该药材的质量及临床疗效。方法：采用试剂盒法对36份样品提取DNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列并双向测序，所得序列经过CodonCode Aligner拼接后，用软件MEGA5.1进行数据分析，包括变异位点分析、种内种间距离计算及系统发育树构建。结果：两头尖药材的ITS2序列长度为216 bp，种内大K2P距离为0.014，种间的小K2P距离为0.021；NJ树结果显示两头尖与其混伪品可明显区分，表现出良好的单系性。结论：ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别两头尖药材，为其鉴定提供新的技术手段。
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苍耳子药材及其混伪品ITS2序列鉴定研究
目的：应用 ITS2序列快速并准确地鉴定中药材苍耳子，为其药材质量、用药安全提供保障。方法：提取苍耳子药材及其混伪品的基因组DNA、扩增 ITS2序列并测序，采用软件CodonCode Aligner V 4.2对测序峰图进行校对拼接，并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.0软件计算种内种间 Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离,构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：苍耳子药材基原物种种内 K2P 遗传距离为0，药材基原物种与其他混伪品的 K2P遗传距离分布于0.009~0.542；NJ树结果显示苍耳子药材与其混伪品均可明显区分。结论：ITS2序列适用于中药材苍耳子及其混伪品鉴别，进一步验证了DNA条形码技术鉴定中药材的有效性。
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基于SNP位点鉴定砂仁药材物种
目的：为建立基于单核苷酸多态性（SNP）技术鉴别砂仁3个基原（阳春砂A momum villosum、海南砂A momum longiligulare、绿壳砂A momum villosum var. xanthioides）的方法，对这3个种共计60份材料ITS2序列进行分析比较。方法：将实验所得砂仁ITS2序列，应用CodonCode Aligner 软件进行序列拼接比对。用MEGA 5.0导出各序列变异位点，并对变异位点进行分析。为验证结果准确性，下载砂仁3个基原GenBank的所有ITS2序列，共计34条，对结果进行验证。结果：砂仁ITS2序列比对后长度为230 bp，3个不同基原在135 bp和199 bp处存在稳定SNP（s）变异位点。结论：本研究开发的两个稳定的SNP（s）位点可以快速准确地鉴定砂仁药材3个基原。
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维吾尔药材新疆圆柏DNA条形码鉴定研究
目的：本研究采用形态学与DNA条形码技术，建立维吾尔药材新疆圆柏Juniperus sabina L.及其混伪品的鉴别方法。方法：随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶片和果实，比较外观差异；采用ITS2序列对新疆圆柏及其混伪品10份样品进行PCR扩增并测序，结合GenBank获得4条侧柏ITS2序列，比较14份样品ITS2序列种内和种间变异，采用K2P模型构建NJ系统树。结果：4种植物叶片和果实外观相态均有相似之处；DNA条形码ITS2序列鉴定结果显示，14份研究样品ITS2序列长度均为219 bp，种间大K2P距离为0.089。结论：ITS2序列及NJ树可将新疆圆柏与3种混伪品植物区分，为维吾尔药材新疆圆柏的标准化奠定基础。
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药材天麻ITS2特异性引物的筛选
目的：药材天麻由于隶属于单子叶植物兰科天麻属，天麻中含有大量多糖、蛋白质以及大量次生代谢物质，使其提取的DNA质量不高，影响后续的PCR扩增。且ITS2通用引物在单子叶植物部分物种通用性很差。本研究通过对DNA提取过程、PCR扩增过程进行优化，设计出一对用于鉴别天麻药材的ITS2引物，为中药材天麻的鉴定提供一种新方法。方法：以通用ITS2引物扩增出的两条序列为研究对象，经Primer Premier 5.0设计出3对特异性引物，通过对22份样品进行研究，筛选出一条高特异性的ITS2引物。结果：在54益的退火温度下，TM2F-2R对天麻的鉴定效率高达90.9%。结论：TM2F-2R可作为天麻ITS2序列的特异性引物，为天麻的分子鉴定提供了一套准确、稳定的鉴定方法。
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射干与川射干及其混伪品ITS2序列鉴定研究＊
目的：应用ITS2序列对药材射干与川射干及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究，保障临床用药安全。方法：提取射干、川射干及其混伪品和近缘种的 DNA ，经 PCR扩增后测序，通过 CodonCode Aligner V3.7.1对测序序列进行质量分析和拼接，基于MEGA5.1中的K2P模型计算射干与川射干及其混伪品的种内、种间遗传距离及构建系统聚类树。结果：射干的ITS2序列比对后长度为272 bp，种内大K2P距离为0，平均GC含量为52.22%。川射干的ITS2序列比对后序列长度为268 bp，种内大K2P距离为0.004，平均GC含量为67.87%。射干、川射干的种内大K2P距离均小于与混伪品的种间小K2P距离。基于ITS2序列构建NJ聚类树，射干、川射干能各自聚为一支，呈现出较好的单系性，能很好地与其混伪品白及、山菅、黄花射干，以及近缘种德国鸢尾、北陵鸢尾明显区分开。结论：ITS2序列在药材射干与川射干及其混伪品和近缘种的鉴定方面具有很好的鉴定效果，对保障射干与川射干的用药安全具有重要意义。
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蔓荆子药材及其混伪品DNA条形码鉴定研究＊
本研究应用ITS2序列鉴别蔓荆子及其混伪品，收集药材和基原植物样本共46份，通过提取基因组DNA、PCR扩增和双向测序获得ITS2序列，经CodonCode Aligner V4.2拼接注释获得序列，应用MEGA5.0对序列进行分析比对，计算种内和种间遗传距离（Kimura 2-Parameter ，K2P），构建系统发育NJ树进行鉴定。结果表明，蔓荆子药材基于ITS2序列的种内大K2P遗传距离均小于其与混伪品的种间小K2P遗传距离，NJ树显示蔓荆子药材与其混伪品可明显分开，表现出良好的单系性。因此，应用ITS2序列能够准确地鉴定蔓荆子药材及其混伪品。
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基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定
山豆根是我国常用中药材,对山豆根基原植物及其易混伪品进行DNA分子鉴定研究具有重要意义.本文对5科9属38个物种84份山豆根基原植物及其混伪品样品的ITS2序列进行序列变异分析、K-2p遗传距离比较及NJ系统发育聚类树构建.结果表明所研究山豆根基原植物样品种内ITS2序列无变异,与其同属密切相关物种的ITS2序列变异位点为102个,平均K-2p遗传距离为0.072,与其他混伪品的ITS2序列变异位点为200个,平均K-2p遗传距离为0.594.山豆根基原植物在NJ系统发育聚类树上聚为一支,支持率为98.因此,ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区分山豆根基原植物及其混伪品,为山豆根药材及其混伪品的鉴定提供基础.
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党参及其易混伪品的ITS2分子鉴定
目的:对中药党参及其易混伪品进行ITS2条形码鉴定,探讨ITS2条形码序列对党参及其伪品鉴定的可行性.方法:对党参样品进行DNA提取、PCR扩增和双向测序,用CodonCode Aligner3.7.1进行序列拼接,MEGA4.1计算党参基原植物及其易混伪品的种间、种内的K2P距离,并采用P距离法建立N-J树,利用Koetschan等建立的ITS2数据库预测ITS2二级结构.结果:党参基原植物种内平均K2P距离均值为0.0339,与易混伪品的种间平均K2P距离为0.2688,党参的3个基原聚在一起,与易混伪品明显区分.党参与其易混伪品的ITS2二级结构Helix Ⅰ和Ⅲ区存在明显差异.结论:ITS2条形码序列能够鉴定党参及其易混伪品,为党参及其混伪品的鉴定提供了新思路.
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基于ITS2条形码的中药材赤芍及其易混伪品的DNA分子鉴定
目的:对中药材赤芍及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效.方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树.利用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构.结果:赤芍两基源植物ITS2序列长度均为227bp;由所构建的系统聚类树图可以看出,无论芍药还是川赤芍,它们的不同来源样本均分别聚在一起,表现出单系性;比较赤芍及其易混伪品的二级结构发现,赤芍的正品来源芍药与川赤芍彼此间差异甚微,而与其它物种在螺旋区茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面具有较明显区别.结论:ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区别中药材赤芍基源植物与其易混伪品,在中药材的鉴定中具有重要的应用前景.
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大青叶及其混淆品的ITS2序列鉴定研究
目的:对中药材大青叶及其混淆品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效.方法:采用PCR直接测序法,测定核基因ITS2区,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,构建NJ(邻接)树,并利用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构.结果:大青叶基源植物菘蓝ITS2序列长度为191bp,其种内平均K2P遗传距离(0.002)远小于其与混淆品的种间平均K2P遗传距离(0.882);由所构建的系统聚类树图可以看出,各物种均表现出了单系性,而同时又与其它物种明显区分开;比较ITS2二级结构发现,各物种在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异.结论:ITS2作为条形码可以方便快捷的鉴别大青叶正品及其混淆品,对药典中其它药材的相关研究也具有重要的参考价值.
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中药络石藤及其习用品的DNA条形码鉴定
目的:本研究应用ITS2序列鉴定区分络石藤及其习用品广东络石藤、地瓜藤、薜荔藤和扶芳藤.方法:提取以上5种中药基原植物基因组DNA,扩增不同样品的ITS2序列.采用隐马尔科夫模型HMMer进行序列注释,ClustalW法进行序列比对,K2P模型计算种内和种间遗传距离分析,邻接法和大似然法构建进化树.结果:5个物种的ITS2序列长度各不相同,在220-243 bp之间.遗传距离分析显示,5个物种的大种内遗传距离为0.038,小种间遗传距离为0.113,大种内遗传距离大于小种间遗传距离.同时5个物种可以在进化树上区分开来.结论:ITS2序列可以用于中药络石藤及其习用品的分子鉴定,为准确区分该类药材提供新的技术手段.
