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河南山东部分地区家猫汉赛巴尔通体感染情况调查
目的 调查河南、山东部分地区家猫汉赛巴尔通体血清抗体及菌血症情况.方法 间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法调查314份家猫血清抗体情况,通过聚合酶链反应(PCR)和测序对血培养产物进行病原学鉴定.结果 用ELISA法共检测314份标本,总的抗体阳性率为29.6%,＜6月龄的幼猫阳性率较低(19.3%),＞2岁的老猫抗体阳性率高(37.5%),雌性和雄性之间没有明显差别,血培养共培养出42份可疑阳性,PCR及序列分析证实为汉赛巴尔通体.结论 河南、山东部分地区家猫均存在汉赛巴尔通体感染情况,汉赛巴尔通体是家猫感染的主要菌种.
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侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备
在广西临桂罗汉果花叶畸形病株上获得了一个线状病毒分离物LGL-1,寄主范围、蚜传能力测定、病毒粒子形态和细胞病理特征研究表明,它是马铃薯Y病毒科成员.采用马铃薯Y病毒科特异性简并引物做PCR扩增,并测定了分离物LGL-1的基因组3′-末端序列,序列分析表明它是小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV).系统进化树分析揭示,世界范围内的ZYMV分离物主要可分为3大群体,分离物LGL-1为中国特有群体Group Ⅲ成员.原核表达制备了分离物LGL-1的外壳蛋白抗血清,明确了ZYMV是引起广西罗汉果病害的主要病毒,并且比较了原核表达法和提纯病毒法制备的抗血清,在病样的间接ELISA法检测中结果的差异.
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六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究
初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据.利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔.通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度.此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度.通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求.ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应.SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应.本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础.
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猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立
以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPV NS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1.电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性.将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原佳包被浓度为1.9 μg/mL,血清佳稀释度为1:80,阳性判断标准定为OD待检血清＞0.4且OD待检血清/OD标准阴性值＞2.0.用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2％,与国外同类试剂盒的符合率为92.1％,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测.
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寨卡病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的初步建立
初步建立了寨卡病毒(Zika virus) IgG抗体的间接ELISA检测方法,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据.选取寨卡病毒四种抗原,即E蛋白胞外区(Ectodomain)、NS1蛋白、C蛋白和rEⅢ蛋白进行重组表达和纯化,分别包被ELISA板并用间接法检测寨卡病人临床血清和正常人血清,确定每种检测抗原的检测敏感度和特异度.重组表达并纯化的四种寨卡病毒抗原浓度和纯度均达到检测要求.间接ELISA检测结果显示E蛋白胞外区和NS1蛋白的检测敏感度和特异度均达到较高水平,但C蛋白和rEⅢ蛋白的检测敏感度很低,不适合作为寨卡病毒的检测抗原.本研究初步评价了寨卡病毒四种抗原检测相应IgG抗体的敏感度和特异度,为研制血清学诊断试剂奠定了基础.
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海马提取物调控PI4-K激酶活性
目的 海马是一种具有抗衰老、抗疲劳及抗肿瘤的中药,迄今对其分子作用机制不十分清楚.肌醇磷脂激酶(PI4-K)作为PI信号通路中起重要作用的激酶,位于信号通路的上游,应是寻找新药十分关键的靶分子.方法 利用人红细胞膜内翻外的技术,将存在于细胞膜内侧的肌醇磷脂激酶(PI4-K)暴露在外,成为IOV-PI4-K抗原蛋白;用IOV-PI4-K抗原蛋白与其PI4-K单克隆抗体(A6D)的ELISA检测技术,对海马提取物进行了初步研究.结果 从海马提取物中筛选出了对PI4-K与抗体活性亲和力具有上调或下调作用的二种不同组分,提示在这二种组分里可能存在有不同的分子对PI4-K有着上调或下调的作用.结论 从上述二种组分里有可能开发出治疗肿瘤和抗衰老的药物.这一筛选方法也可做为今后的药物筛选提供一种新的思路.
关键词： 肌醇磷脂激酶PI4-K 海马提取物 间接ELISA 人红细胞膜内翻外 药品筛选 -
新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测
目的 检测新城疫病毒(NDV)血凝素一神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性.方法 采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性.结果 成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是多的.经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性.结论 融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量.
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埃博拉病毒核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 建立快速而准确的检测蝙蝠埃博拉病毒(EBOV)核蛋白抗体ELISA方法. 方法 合成大肠埃希菌系统密码子优化的扎伊尔埃博拉病毒核蛋白羧基端序列,构建含His标签的原核表达载体pET-28(a)-Z-NP,并转化BL21(DE3)感受态细胞,用1.0 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,目的蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Westernblot鉴定,以纯化蛋白为包被抗原建立抗体间接ELISA方法. 结果 成功构建原核表达质粒pET-28 (a)-Z-NP,可溶表达的目的蛋白纯化后经Western blot检测,能与His单抗和已知阳性血清特异性反应.建立的ELISA方法检测轮状病毒、来宾病毒、汉城病毒、玄松病毒感染蝙蝠血清均无交叉反应,已知阳性血清稀释至1∶1 600仍为阳性,试验的批内及批间变异系数均＜10％.用此方法检测采自云南省西双版纳地区的15份棕果蝠血清,其中2份阳性,且与Westernblot验证结果一致. 结论 建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,可用于蝙蝠扎伊尔埃博拉病毒核蛋白抗体的检测.
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埃博拉病毒VP40蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 以埃博拉病毒(EBOV) VP40基因原核表达产物为抗原建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法. 方法 在分析EBOV VP40基因稀有密码子(大肠埃希菌系统)的基础上去除5 '和3'端稀有密码子,合成VP40基因,构建VP40蛋白原核表达载体pET22b-VP40,并转化至BL21 (DE3)菌,在1.0 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.以纯化蛋白为抗原,建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法. 结果 成功构建重组质粒pET22b(+)-VP40,表达的VP40蛋白经SDS-PAGE鉴定分子质量单位为40 ku,与预期值相符；Western blot检测证实VP40重组蛋白能被抗VP40单克隆抗体识别.以该蛋白为包被抗原建立监测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法,其敏感性和特异性均为100％. 结论 成功构建了pET22b(+)-VP的重组质粒,并诱导表达VP40蛋白.该蛋白具有免疫反应性,以该蛋白为抗原建立的ELISA方法具有较高的特异性和稳定性,可用于埃博拉出血热的诊断和流行病学调查.
关键词： 埃博拉病毒 原核表达 VP40蛋白 Western blot 间接ELISA -
检测犬弓形虫SAG3抗体间接ELISA方法的建立
目的 以弓形虫重组SAG3蛋白为抗原,建立一种检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法. 方法 采用棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和阳性血清稀释度,再对该方法的封闭剂以及封闭时间、犬弓形虫阳性血清孵育时间、二抗稀释度以及加入显色液孵育时间等各项条件进行优化;通过对弓形虫感染犬血清及犬心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫感染血清的检测评价方法的敏感性和特异性. 结果 该方法佳优化条件分别为:抗原包被浓度0.82 μg/孔,封闭剂为含10％胎牛血清的PBST,被检血清稀释度1∶20;兔抗犬酶标二抗稀释度1∶8 000.优化的ELISA敏感性为1∶1 280,犬心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫感染血清均未发生交叉阳性反应;批间、批内重复性试验的变异系数均＜15％. 结论 建立的ELISA方法特异性较强,敏感性高,批内、批间重复性较好,可用于犬弓形虫感染的检测.
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结核分枝杆菌Ag85蛋白复合物的原核表达及其在血清学诊断中的应用研究
目的 构建结核分枝杆菌Ag85复合物原核表达载体并表达和纯化重组蛋白,评价该家族蛋白在结核病血清学诊断中的应用价值. 方法 以标准株H37Rv基因组为PCR模板扩增fbpA、fbpB及fbpC基因并克隆至原核表达载体,转化至C43(DE3)菌株后经诱导、表达、纯化获得重组蛋白Ag85A、Ag85B、Ag85C.分别以纯化蛋白包被酶标板,采用方阵滴定确定Ag85A、Ag85B、Ag85C蛋白间接ELISA的佳条件,用优化的ELISA检测367份健康对照组血清及86份痰涂阳性结核病患者血清中的特异IgM、IgG抗体. 结果 成功构建Ag85复合物基因的重组质粒,经诱导表达获得Ag85A、Ag85B、Ag85C重组蛋白.分别以纯化的Ag85A、Ag85B、Ag85C为包被抗原,采用ELISA检测结核病人血清IgG抗体,灵敏度分别为65.1％、69.8％和41.8％,特异性分别为75.1％、78.1％和64.2％;以Ag85B+ Ag85A或Ag85C IgG抗体阳性为判断标准,检测血清结核分枝杆菌IgG抗体的灵敏度为60.4％,特异性为86.1％. 结论 以Ag85B+Ag85A或Ag85C血清IgG抗体阳性为判断标准,检测血清结核分枝杆菌IgG抗体具有较好的灵敏度与特异性,可作为结核病血清学诊断方法.
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炭疽杆菌PA63蛋白原核表达及抗体检测间接ELISA方法的建立
目的 原核表达炭疽杆菌PA63蛋白,以此为包被抗原建立检测相应抗体的间接ELSIA方法,用于炭疽血清免疫学诊断. 方法 选择炭疽杆菌PA63为目的基因,合成全长序列,构建pCzn1-PA63质粒,克隆至E.coli ArcticExpress表达菌株,优化IPTG表达条件,通过包涵体变性复性,Ni柱纯化获得可溶性PA63蛋白.利用棋盘滴定法确定包被PA63蛋白的佳浓度及血清佳稀释度建立间接ELISA方法,对炭疽阳性血清和阴性血清进行检测,计算ROC曲线下面积,确定Cut-off值,灵敏度与特异度. 结果 成功构建了pCzn1-PA63质粒,IPTG 37℃诱导表达蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性,纯化后获得PA63蛋白.用5 μg/ml PA63包被酶标板,血清稀释度为1∶50建立的ELISA方法;ROC 曲线下面积为0.969(P＜0.01),Cut-off值为0.2865时的灵敏度为91.18％(95％可信区间为76.32％-98.14％),特异度为94.64％(95％可信区间为85.13％-98.88％). 结论 成功表达具有生物活性的重组炭疽杆菌PA63抗原蛋白,以此为包被抗原建立的间接ELISA检测炭疽PA抗体,具有较高的灵敏度与特异度,可用于炭疽的血清学诊断.
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抗ALT抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 建立免疫小鼠体内抗人丙氨酸氨基转移酶(ALT)抗体的间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系.方法 利用人ALT为包被抗原,以1:40 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗,采用棋盘滴定法确定抗原和对照血清(阴性、阳性)佳工作浓度及ELISA封闭液的浓度建立ELISA体系.结果 包被抗原和血清的适宜浓度或稀释度分别为1:5 000和1:1 000;用4%BSA封闭18 h～z4 h效果好.结论 建立的ELISA方法稳定,简便易行,能准确检测免疫小鼠血清抗体的效价,并可用于抗ALT单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选.
关键词： 丙氨酸氨基转移酶(ALT) 单克隆抗体 间接ELISA 筛选体系 -
恙虫病东方体Sta56抗原的原核表达、纯化及其在间接ELISA中的应用
目的构建含恙虫病东方体sta56基因的重组表达质粒,在E.coli中表达Sta56重组抗原,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病. 方法从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组质粒TOPO-sta56扩增出截短的sta56,定向插入pET30a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot进行分析;采用电洗脱方法纯化重组抗原并应用于间接ELISA检测恙虫病. 结果以截短的sta56基因片段构建了重组表达质粒pETOt957,重组的Sta56抗原可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,SDS-PAGE显示了一条相对分子质量(Mr)为40.3×103的蛋白表达带,Western blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别.电洗脱纯化的重组抗原应用于间接法ELISA检测恙虫病,与间接免疫荧光法IFAT比较,其敏感性和特异性分别为91.7%和76.5%. 结论在大肠杆菌中表达的Sta56重组抗原具有免疫反应性,纯化后可用作免疫诊断试剂.
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新疆出血热病毒多表位基因的原核表达及间接ELISA方法的建立
目的：原核表达纯化新疆出血热病毒( XHFV) YL04057株的多表位肽,以其为抗原建立检测动物血清抗XHFV抗体的间接ELISA方法。方法依照对XHFV YL04057株核蛋白和糖蛋白氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇位点分析,设计包含有保守性强的共6个优势B细胞表位的多表位基因片段,经串联重复成为双拷贝多表位基因 MEPX2,采用化学法合成后构建原核表达质粒pET-32a(+)-MEPX2,经诱导表达和镍柱亲和层析纯化获得重组rMEPX2多表位肽,Western blot检测其抗原性,以其作为包被抗原采用方阵滴定法建立间接ELISA方法检测动物血清,并与商品化试剂盒检测结果进行比较。结果经双酶切鉴定和测序证实构建的重组表达质粒pET-32a(+)-MEPX2正确,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定证实rMEPX2表达正确,相对分子质量约为49×103,能被His-tag单抗及天然感染XHFV的羊血清特异性识别。以纯化的rMEPX2为抗原建立了检测XHFV IgG抗体的间接ELISA方法,用此法对108份绵羊血清样品进行检测,并与双抗原夹心法商品化试剂盒检测比较,结果显示基于rMEPX2建立的检测方法具有较高的特异性。结论成功获得抗原性强的重组多表位肽rMEPX2,以其为抗原建立的间接ELISA方法可用于XHFV特异性抗体的检测。
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间接ELISA法对H pylori免疫牛初乳中抗体的检测
目的:建立间接ELISA法测定牛初乳中Hpylori抗体的水平,并观察特异性抗体的产生规律.方法:本试验以H pylori全菌抗原免疫妊娠母牛,每头牛每次肌肉注射4×109CFU全菌抗原,收集分娩后7 d内的初乳.以间接ELISA法检测其中Hpylori体水平.结果:H pylori能有效地引起免疫应答,成年牛初乳中的抗体效价在分娩当天达到大值5.84,高于青年牛的3.51(P＜0.05),随后迅速下降.对照奶牛仅在分娩当天检测到微弱阳性.结论:成年牛的对H pylori的免疫应答好于青年牛.
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人血白蛋白免疫优势抗原表位的筛选及鉴定
目的：筛选人血白蛋白（HSA）免疫优势抗原表位，为建立一种高特异性HSA制品快速检测方法提供基础。方法采用生物信息学方法比较人与其他物种（猪、马、牛、羊）白蛋白基因序列并预测其抗原表位，获得HSA免疫优势抗原表位；利用大肠杆菌优势密码子获得相应基因，插入PGEX-4T-2载体克隆表达得到重组HSA表位抗原；间接ELISA评价上述重组表位的特异性。结果筛选3个HSA抗原表位，分别位于H1〔126～162氨基酸（aa）〕、H2（314～355aa）、H3（373～424aa），获得相应基因片段；得到重组抗原的相对分子质量（Mr）分别为3.01×104、3.06×104和3.17×104；抗原活性检测显示373~424aa序列表位具有较高活性，其酶标抗体竞争抑制反应的IC50为1.635 mg/L，高于酶标HSA抗体。结论实验获得了特异性HSA免疫优势抗原表位，对研制一种快速、特异的HSA检测试剂具有重大意义。
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参与评价抗人促红细胞生成素单克隆抗体参考品国际协作国内部分的研究
目的 通过不同的检测平台和实验方法对9种抗人重组人促红细胞生成素(rhEPO)单克隆抗体的测试结果的比较,评价其在临床单纯红细胞再生障碍性贫血(pure red cell aplasia,PRCA)rhEPO免疫原性研究中应用的可行性.方法 中国食品药品检定研究院(中检院)和沈阳三生制药有限责任公司(三生制药)采用直接ELISA评价待测参考品的结合性抗体性质,厦门特宝生物工程股份有限公司(特宝生物)采用间接ELISA评价待测参考品的结合性抗体性质;3家单位均采用EPO依赖细胞株UT7/EPO细胞的增殖抑制法评价待测参考品的中和性抗体性质.结果 不同检测平台和检测技术均能对抗rhEP0单克隆抗体参考品的性质进行有效评价.结论 多种检测平台和检测方法的应用,对rhEP0在临床研究和上市后的免疫原性评价或PRCA的监测具有重要意义.
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家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立
目的 表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法.方法 参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列(AB020025)针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段.将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)载体中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNTI抗体的ELISA方法.结果 成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性.应用重组蛋白DNTI为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法.试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,适血清稀释度为1:100.结论 建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础.
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家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素(PRN)蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立
目的 表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法.方法 参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列(AY376325)设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段.将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21( DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法.结果 成功克隆了prn全基因序列,并在E.coli BL21( DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性.应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法.试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,适血清稀释度为1:40.结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础.
关键词： 兔 支气管败血波氏杆菌 百日咳杆菌粘附素(PRN) 原核表达 间接ELISA
