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基于序列的鳞毛蕨属贯众药材基原植物的鉴定研究
目的：研究psbA-trnH序列在近缘贯众基原物种鉴定中的有效性。方法：对常见鳞毛蕨属贯众基原物种psbA-trnH序列进行PCR扩增及测序，原始峰图通过CodonCodeAligner软件查看、拼接和校对，并根据GenBank注释截取标准条形码数据。利用TaxonGap方法在实验物种范围（9物种19样品）和扩大范围（17物种44样品）内评估该序列的鉴定效率。结果：物种鉴定范围扩大后psbA-trnH序列鉴定成功率由100%（9/9）降至82.4%（14/17），种内异质性数值高于种间可分离性的比例，由11.1%（1/9）上升为52.9%（9/17）。结论：psbA-trnH序列可作为整体贯众同名异物品种鉴定的推荐条形码，实际应用中需注意种内采样代表性的问题。
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鸡血藤、滇鸡血藤、大血藤等血藤类药材的psbA-trnH条形码分子鉴定
目的:中国药典收载的鸡血藤、大血藤、滇鸡血藤及相关物种均有“血藤”之称,其各自的来源不同,功效主治不同,不能混用.为确保其临床用药的安全、有效,本研究应用DNA条形码序列psbA-trnH对鸡血藤、大血藤、滇鸡血藤及其混伪品进行鉴定研究.方法:通过对样本进行基因组DNA提取,PCR扩增sbA-trnH序列.所得序列经拼接后,用MEGA5.0和DNAMAN进行种内种间序列分析,构建NJ树,对psbA-trnH序列在血藤类药材中的鉴定能力进行评估.结果:鸡血藤、大血藤和滇鸡血藤序列长度和GC含量各不相同,psbA-trnH种内序列相似度高,均高于它们与混伪品间的序列相似性.鸡血藤、大血藤、滇鸡血藤与其他非药典收载的血藤类药材的种间小K2P距离分别为0.137、0.426和0.003,均大于其种内大遗传距离0.014、0.004和0.在NJ树中,鸡血藤、大血藤均单独聚为一支,能明显的与其他混伪品区分开,滇鸡血藤与异形南五味子聚为一支.结论:psbA-trnH序列能准确鉴定鸡血藤、滇鸡血藤、大血藤药材及其混伪品,该条形码分子鉴定方法可作为传统鉴定方法的有效补充.
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探索psbA-trnH序列对竹茹、天竺黄及其近缘物种的鉴定＊
目的：采用psbA-trnH 序列对竹茹、天竺黄及其近缘物种进行DNA条形码鉴定研究，保障临床用药准确、安全。方法：收集竹茹、天竺黄及其近缘物种共71份材料，提取基因组DNA、PCR扩增并双向测序，经CodonCode Aligner V 4.2拼接获得序列，应用 MEGA5.0比对分析，计算种内及种间 Kimura-2-Parameter（K2P）遗传距离并构建系统发育树。结果：竹茹、天竺黄各基原及其近缘物种基于psbA-trnH序列的种内大K2P遗传距离均小于其与近缘物种的种间小 K2P遗传距离；NJ树图结合 MEGA 比对结果显示，基原植物青杆竹与青皮竹之间无法区分，而竹茹、天竺黄及其他基原物种之间均可较好地区分并呈现明显的单系性。结论：基于psbA-trnH 序列可以准确地鉴定多基原药材竹茹、天竺黄及其近缘物种。
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虾脊兰属植物 DNA 条形码的确立
目的：结合ITS2、psbA-trnH和matk序列对兰科虾脊兰属植物进行物种区分鉴定研究，并确立能准确鉴别虾脊兰属植物的序列或者序列组合。方法：采用试剂盒法对已收集的6种虾脊兰属植物进行总DNA的提取，通过扩增及测序，运用codencodeV4.2软件对所得序列进行拼接与剪切，使用MEGA5.0对ITS2、psbA-trnH和matk序列3种序列分别进行比对分析，计算种内及种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树。结果：实验共得到序列56条（包含GenBank序列17条），ITS2序列和matK序列其种内大遗传距离小于种间小遗传距离，而该属psbA-trnH序列种内遗传距离范围和种间遗传距离范围有重合。结论：ITS2序列和matK序列可以作为虾脊兰属部分植物的鉴定序列，而psbA-trnH序列不能用于虾脊兰属植物的鉴定。
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基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定
目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性.方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性.收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定.结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列.知母序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异大值0.003 5,种间变异小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支.共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides.结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定.所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品.
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ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物
目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力.方法:选择psbA-trnH,rbcL,marK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcoding gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力.结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6％,83.6％,96.4％,98.2％,其鉴定成功率除rbcL为77.8％,75.9％外都为100％,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势.ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5％,87.6％.结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合.
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罂粟属植物核心DNA条形码的筛选
DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术.为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列.应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析.分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开.综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码.
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基于DNA条形码技术的维吾尔药材桑葚基原鉴定研究
该研究通过分析多途径来源的新疆桑属植物及药材样本的ITS2,psbA-trnH序列,为药材分子鉴定提供依据.以51个新疆桑属植物及药材为样本,对其ITS2,psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序,用MEGA 6.0计算其种内、种间Kimura 2-parameter(K2P)距离,分析变异位点,并构建NJ鉴别树.ITS2序列分析结果显示,桑Morus alba、鞑靼桑M.alba var.tatarica、黑桑M.nigra种内无变异;桑与鞑靼桑种间无变异;桑与黑桑种间存在13个变异位点,种间平均KP2遗传距离为0.04;桑与药材样本间无信息变异位点,NJ鉴别树可将桑及鞑靼桑与黑桑区分.psbA-trnH序列分析结果显示,桑与黑桑种内各有1个变异位点,3种植物种间存在插入/缺失变异,可相互区分;种间变异与药材样本内变异一致.因此,ITS2序列可将来源于桑、鞑靼桑的药材样本与黑桑区分,psbA-trnH序列可将来源于三者的药材样本区分,为维吾尔药材真伪鉴别及市场监管提供依据.
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基于DNA条形码技术对23种未知黎药进行物种鉴定
该研究利用DNA条形码技术对23种未知黎药进行物种鉴定.采用试剂盒法提取了23种药材的总DNA,并利用PCR技术扩增其ITS2,psbA-trnH序列并双向测序,利用CodonCode Aligner v7.0.1软件对测序峰图进行正反向序列拼接,去除引物区及低质量序列获得ITS2,psbA-trnH序列,并将其输入到中药材DNA条形码数据库和NCBI GenBank数据库中进行检索,尝试对这23种药材进行物种鉴定.并以鉴定结果的相似度≥97％即确定到物种水平;介于97％和90％即确定为属级水平;低于90％即确定到科级水平这一原则作为鉴定标准,有17种药材可以鉴定到物种水平,5种药材可以鉴定到属级水平,1种可以确定到科级水平.由此可见DNA条形码技术可以快速、准确的鉴别无背景信息的未知药材.
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基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较
为考察ITS2序列和sbA-trnH序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力,该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究.采用MEGA 5.1对获得的ITS2和sbA-trnH进行序列比对,计算种内和种间kimura2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统发育树.结果显示,车前和平车前的ITS2序列长度分别为199,200 bp;两者的ITS2序列种内大K2P遗传距离均小于与混伪品的小种间K2P遗传距离;基于ITS2序列构建的NJ树中,车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性,都能相互明显区分.表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分.车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp,两者的psbA-trnH序列种内大K2P遗传距离小于与混伪品的小种间K2P遗传距离;基于psbA-trnH序列构建的NJ树结果显示,除大车前外,车前子药材与其余混伪品可以明显区分.因此,ITS2序列作为DNA条形码,车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力,对保障车前子用药安全具有重要意义.
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基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究
该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术.首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物sbA-trnH,ITS,trnL-trnF,matK,rbcL序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用Gene-Marker V1.80进行分析.根据分析结果终选择sbA-trnH荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材.结果表明,通过psbA-trnH荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材.研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性.
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枫斗类石斛cpDNA psbA-trnH的序列分析与鉴别
本研究对常见枫斗类石斛cpDNA的psbA-trnH区进行了测序,利用MEGA 4.0对该区序列进行了比较分析.结果显示:15种常见的枫斗类石斛的psbA-trnH序列长度为721～767 bp,变异位点42个,简约信息位点11个.以Kimura-2参数计算遗传距离,常见枫斗类石斛的种间遗传距离为0.001 3～0.018 3,平均遗传距离为0.014 8.不同石斛种间均存在序列差异,全序列中共出现6处indels,导致种间片段长度差异较大;暂未发现所检测的枫斗类石斛居群间在psbA-trnH区的序列存在差异.利用枫斗类石斛psbA-trnH序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种的psbA-trnH序列的测定,成功鉴别了待检种.cpDNA的psbA-trnH区可作为枫斗类石斛分子鉴别的候选标记.
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连翘败毒丸中原料药材的分子鉴别
为研究分子标记技术在成药鉴定方面的应用,本文选用连翘败毒丸为研究对象,采用改良CTAB法提取其总DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对psbA-trnH和rbcL两个叶绿体序列进行梯度扩增,将扩增产物与口pEASyTM-T5 vector连接后,转化到大肠杆菌Transl-T1感受态细胞中,挑取单克隆,并选择阳性克隆进行测序.所得序列校正、比对后,进行BlastN比对分析,同时采用MEGA 4.0软件构建系统聚类树.结果表明,通过psbA-trnH序列分析可以鉴定出9种原料药材,rbcL序列分析可以鉴定出6种原料药材.本研究结果说明采用分子标记技术鉴定中成药原料具有一定的可行性.
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中药材威灵仙及其伪品DNA条形码鉴别研究
利用DNA条形码技术对中药威灵仙及其伪品进行鉴别,为威灵仙分子鉴定提供更多依据与参考.本实验利用psbA-trnH序列对来自3个属10个物种的72份威灵仙及其伪品样本进行扩增测序,结合GenBank数据库中7个属21个物种的284条序列,分析ITS、ITS2、psb A-trnH、rbcL、matK各序列种内与种间变异、遗传距离、barcoding gap,并采用近距离法(nearest distance)和相似性搜索算法(BLAST1)评价5条序列的鉴定成功率.结果显示psbA-trnH序列在两种DNA序列鉴别评价方法中的效率均较高,且该序列种间变异较大,在barcoding gap检验中,其序列重叠区较少,种间与种内变异分布呈两边分开的趋势,NJ树分析可将各物种分开,差异显著.综合鉴别效率和扩增成功率,推荐使用psbA-trnH序列作为威灵仙药材及其伪品的鉴别序列.
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不同基原甘草的分子鉴定及市售甘草药材的质量评价
甘草是我国常用的大宗中药材之一,在《神农本草经》中被列为上品.2015版《中华人民共和国药典》规定,乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、光果甘草Glycyrrhiza glabra L.及胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.的干燥根及根茎可作为甘草入药.然而不同基原甘草药效差异显著,而通过传统方法对其进行鉴别十分困难.为了快速、准确地对不同基原甘草进行鉴定,本文从全国7省份21居群采集了240株甘草.利用PCR扩增获得了长度为616 bp的ITS序列以及389 bp的psbA-trnH序列;通过DNAMAN比对分析,在ITS序列中找到4个变异位点,并确定了2种ITS单倍型,在psb A-trnH序列中找到3个变异位点,并确定了4种psbA-trnH单倍型;结合ITS及psbA-trnH序列分析,确定了3种基原甘草的分子鉴定方案.利用该方案对来自全国4个主要中药材市场的40份甘草药材进行了准确鉴定,并进一步利用HPLC法测定各药材中2种三萜类有效成分(甘草酸及异甘草酸)及4种黄酮类有效成分(甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷)的含量,应用SPSS 21.0对HPLC结果进行统计学分析,从而对市售甘草药材的质量进行评价.本文为不同基原甘草的准确鉴定提供了分子鉴定方案,并且对甘草药材的流通现状及质量评价具有指导意义.
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叶绿体psbA-trnH序列鉴定药食同源肉桂类药材
目的 基于叶绿体psbA-trnH序列对肉桂类药材进行鉴定研究,促进规范用药,保障食品安全规范.方法 对8种肉桂类药材psbA-trnH序列进行扩增和测序,应用MEGA 5.0分析其种内种间K2P遗传距离,并构建系统进化树.结果 肉桂psbA-trnH序列长度368 bp,种内序列高度保守,肉桂与其近缘物种种间变异位点多,种间K2P遗传距离明显大于种内K2P遗传距离,NJ树显示肉桂能与近缘物种完全区分开.结论 基于psbA-trnH序列的DNA条形码技术能够准确鉴定肉桂及其相关近缘种.
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茜草及其混伪品DNA条形码鉴定
目的 正确鉴别中药材茜草及其混伪品.方法 本实验对茜草及其混伪品共13个物种的psbA-trnH、matK和rbcL共317条序列进行分析,建立DNA条形码鉴定体系.采用MEGA5.1进行种内种间变异及K2P(Kimura-2-Parameter)遗传距离分析,并构建NJ系统聚类树,评价psbA-trnH、matK和rbcL序列及其组合对茜草与混伪品的鉴定能力.结果 76份基原植物样品的DNA均能成功提取,psbA-trnH、matK和rbcL序列扩增成功率分别为100％、96％和99％.psbA-trnH、matK和rbcL单个序列及其两两组合,能将茜草与不同属的混伪品成功区分,但对同属其他物种鉴定效果不理想.psbA-trnH+ matK+ rbcL组合序列鉴定效果好,种内K2P遗传距离为0～0.001 4,种间K2P遗传距离0.000 7～0.630 3;NJ树显示茜草能与其混伪品茜草属其他8个物种以及紫金牛、丹参、川赤芍、蓬子菜明显区分.市场购买的30份未鉴定的茜草药材中,22份样品能成功扩增3个基因片段,采用NJ树分析,其中11份样品与茜草聚为一支,剩余样品聚为单独3支,为茜草属其他物种.结论 psbA-trnH+matK+ rbcL组合序列能作为DNA条形码对茜草及其混伪品进行鉴定.
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基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定
目的 筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列.方法 采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter (K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树.结果 共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100％.比对后序列长度为255～723 bp,GC量范围为30.6％～68.2％.psbA-trnH基因序列的大种内遗传距离均小于小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap.基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定.结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列.
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紫苏及其变种的分子鉴定和亲缘关系研究
目的 构建紫苏属种、变种之间系统发育关系,准确鉴别紫苏Perilla frutescens var.arguta、白苏P.rutescens与其他变种.方法 提取紫苏、白苏及其他变种的DNA,对ITS和sbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内(变种内)种间(变种间)Kimura 2-parameter (K2P)遗传距离.采用简约法(MP)和邻接法(NJ)构建分子系统树,进行系统发育和鉴定分析.结果 ITS和sbA-trnH MP系统树显示白苏和紫苏的不同地域的样本聚为一单系分支(支持率为100％和93％),紫苏与回回苏构成姐妹群分支(支持率为95％和90％),野生紫苏和耳齿紫苏构成一单系分支(支持率为100％和90％);白苏、紫苏与其他变种间的ITS和sbA-trnH序列遗传距离0.008 21～0.018 18和0.002 38～0.029 31,明显大于白苏与紫苏间遗传距离0～0.001 65和0,大于各变种内遗传距离.结论 白苏和紫苏合并为一个种紫苏;紫苏与回回苏亲缘关系近,野生紫苏与耳齿紫苏亲缘关系近;ITS和sbA-trnH序列可以准确鉴别紫苏与其他变种.
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娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究
目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列.方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体sbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcodinggap检验及NJ树聚类分析.结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100％,种间小变异大于其种内大变异,且鉴定效率为候选序列中高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明sbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果.结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列.
