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江苏省徐州市出血性大肠埃希菌O157∶H7感染性腹泻的监测研究
目的 系统监测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7(O157∶ H7)感染并发肾衰(HUS)、腹泻患者、宿主动物、蝇类、食品携带O157∶H7的状况,为预警监测体系建立提供参考依据.方法 采集徐州市疫情暴发点和监测点腹泻患者粪便、蝇类和食品标本分离菌株.应用PCR技术检测志贺毒素基因stx.结果 1999-2011年徐州市累计报告O157∶H7引起的感染性腹泻并发HUS 132例.腹泻患者带菌率1.2％、蝇类带菌率0.5％、食品带菌率1.0％、宿主动物带菌率3.1％.菌株带毒由stx1和stx2共存发展为以不带毒为主.结论 江苏省徐州市O157∶H7感染自1999年、2000年暴发流行后,该市疫情一直稳定.腹泻患者带菌率、宿主动物带菌率、蝇类带菌率、食品带菌率及菌株带毒情况发生了改变.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 腹泻病 监测 -
我国大肠埃希菌O157∶H7分离株大质粒pO157变异性研究
目的 分析我国分离的大肠埃希菌O157:H7菌株中大质粒pO157的变异情况.方法 采用限制性内切酶酶切法分析质粒酶切图谱,而后采用嵌套引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,并用Southern blot进行验证,后测序.结果 根据酶切图谱将60株大肠埃希菌O157∶H7分为A～E5个群,而进一步研究表明造成A群与C群HindⅢ酶切图谱的不同是由C群中的一个小质粒造成的.PCR结果显示A群与C群中的引物对5和25,B群中的引物对25得到的PCR条带与pO157出发菌株不同,其他均相同.测序结果显示造成引物对25在A～C群中与致病性大质粒pO157不同的原因是IS1310序列的插入.结论 我国大肠埃希菌O157∶H7分离株致病性大质粒pO157相对保守,部分菌株中存在插入序列如IS1310,这也是造成我国大肠埃希菌O157∶H7 pO157质粒变异的主要原因.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 pO157 IS1310 -
大肠埃希菌O157∶H7携带stx2::IS1203v基因研究
目的 了解中国部分地区大肠埃希菌O157∶H7菌株携带志贺毒素基因变异状况.方法 采用聚合酶链反应扩增志贺毒素基因,使用核苷酸序列测定判断是否存在志贺毒素的新变种,用HeLa细胞毒性实验研究其细胞毒性的变化.结果 1992-2002年中国部分地区分离到的289株产志贺毒素的大肠埃希菌O157∶H7中有3株菌携带的志贺毒素2(stx2)基因有1.3 kb的插入序列(IS)插入,且这段IS和IS1203变种(IS1203 variant,IS1203v)有100%的核苷酸序列同源性.IS1203v插入到3株大肠埃希菌O157∶H7 stx2基因的位置及开放性读码框(ORF)方向有所不同.除此之外,3株菌原有的stx2基因序列完全一致且为Stx2原型毒素.和Stx2原型毒素相比,这3株携带stx2::IS1203v基因的菌株对HeLa细胞的毒性明显降低.结论 分离到IS1203v插入stx2基因的大肠埃希菌O157∶H7菌株;IS1203v的插入可导致对HeLa细胞的细胞毒性降低.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 志贺毒素 插入序列1203v -
基于核酸适配体SERS技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7的研究
目的 基于核酸适配体表面增强拉曼技术(SERS),建立一种快速检测大肠埃希菌O157∶H7的方法. 方法 将大肠埃希菌O157∶H7与其特异性适配体共孵育,采用原位还原纳米银方法在大肠埃希菌O157∶ H7-适配体表面原位还原纳米银颗粒,形成纳米银壳,通过SERS技术特异性检测目标细菌. 结果 在500～1 900 cm-1范围内采集拉曼信号,在735 cm-1、1 331 cm-1、1 578 cm-1处发现拉曼特征峰.对检测到的拉曼信号峰进行归属分析,735 cm-1来自胞嘧啶与尿嘧啶的代谢产物,1 331 cm-1归属于鸟嘌呤代谢产物,1 578 cm-1归属于蛋白质中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ.将大肠埃希菌O157∶H7、单增李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希菌DH5α混合,通过SERS可快速检出目标细菌大肠埃希菌O157∶H7.试验的重复性良好,低检测限为10 cfu/ml. 结论 基于核酸适配体SERS技术,建立的大肠埃希菌O157∶H7快速检测方法的特异性和灵敏性高、操作简单、省时,费用低,可用于临床大肠埃希菌O157∶H7感染的快速检测.
关键词： 核酸适配体 原位还原纳米银 表面增强拉曼光谱 大肠埃希菌O157∶H7 -
大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析
目的:对江苏省2000和2001年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)的菌株进行O157 O抗原及H7抗原特异性基因检测,了解2000年监测点宿主动物分离O157菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱.方法:用聚合酶链反应法检测O157特异基因、H7特异基因,多重引物聚合酶链反应法检测VT1、VT2、eaeA、hly等毒力基因并进行分析.结果:134株血清玻片凝集试验初筛为E.coli O157∶H7的菌株经特异基因检测确定为E.coli O157的占72.4%(97/134),E.coli O157∶H7的仅为29.1%(39/134);非O157菌株占26.9%(36/134),有44.3%(58/134)的O157菌株鞭毛抗原不是H7.2000年宿主动物分离菌株,经特异基因检测为非O157的不携带毒力基因(0/18);为E.coli O157∶H?的菌株,毒力基因携带率为10.7%(3/28);确定为E.coli O157∶H7的菌株,毒力基因携带率高达93.1%(27/29),且毒力基因型以VT2+eaeA+hly为主.结论:特异性基因检测鉴定E.coli O157∶H7,可大大减少血清玻片凝集试验的误判,结合毒力基因检测,可分析E.coli O157∶H7菌株毒力基因型的变化,对制定切实有效的防制对策控制E.coli O157∶H7流行具有重要意义.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 特异性基因 毒力基因 -
基于全菌消减SELEX技术的体外筛选大肠埃希菌O157∶H7适配体研究
目的 筛选出能特异性识别大肠埃希菌O157∶H7的单链DNA(ssDNA)适配体并进行鉴定.方法 利用全菌消减SELEX技术,以完整菌体为靶标菌和消减菌,通过体外筛选方法筛选出大肠埃希菌O157∶H7特异性ssDNA适配体.利用荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜、克隆测序、Chromas和DNAMAN分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行特异性鉴定.结果 经过7轮全菌消减SELEX筛选,荧光分光光度计检测结果鉴定第六轮文库富集达到饱和;通过测序分析、荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜特异性检测,获得1条与大肠埃希菌O157∶H7特异性结合的适配体Aptamer1.结论 利用全菌消诚SELEX技术成功筛选获得大肠埃希菌O157∶H7特异性ssDNA适配体.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 适配体 全菌消减SELEX技术 特异性 -
小鼠肠道菌群的多样性不因大肠埃希菌O157∶H7感染而降低
目的 探讨大肠埃希菌O157∶H7感染对小鼠肠道菌群的影响.方法 采用大肠埃希菌O157∶H7菌悬液,灌胃制备感染小鼠.随后测定小鼠的生长情况和死亡率;收集肠道菌群,DGGE检测小鼠个体间肠道菌群的变化,高通量测序检测组间感染小鼠肠道菌群的变化.结果 大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠与正常对照组小鼠相比,小鼠体重、死亡率差异无统计学意义.DGGE结果显示,在不同小鼠个体之间,它们的肠道细菌的种类和数量存在明显差异.高通量测序结果显示,大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠肠道菌群的多样性高于对照组,但优势菌的丰度有显著变化.结论 大肠埃希菌O157∶H7感染,尽管极大改变了小鼠肠道优势菌群的比例,但没有降低其多样性.另外,小鼠个体间肠道菌群多样性的差异在微生态研究中不容忽视.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 肠道菌群 小鼠 高通量测序 DGGE -
酶解法制备姜汁及其抑制大肠埃希菌O157∶H7的研究
目的 探究酶解对生姜出汁率及姜汁悬浮稳定性的影响,并测定经过酶解处理及未经酶解处理的生姜姜汁对大肠埃希菌O157∶H7的抑菌活性.方法 新鲜的生姜清水洗净后切块,放入组织捣碎机中打浆,所得浆液利用果胶酶和淀粉酶进行酶解.采用共培养法测定了制得的姜汁对大肠埃希菌O157:H7的抑菌活性.结果 适酶解条件为,加入3 mg淀粉酶60℃酶解50 min,灭酶后将pH调至4,再加入3 mg果胶酶于45℃酶解50 min.结果显示经酶解处理的姜汁对大肠埃希菌O157:H7的抑菌率远大于未经酶解处理的姜汁,酶解处理的姜汁其抑菌率高达到86％.结论 该方法能够有效提高生姜的出汁率及姜汁对大肠埃希菌O157:H7的抑菌效果.
关键词： 生姜 酶解 抑菌 大肠埃希菌O157∶H7 -
大肠埃希菌O157∶H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用
目的 建立一种能够满足现场快速检测、完全脱离实验室仪器设备的大肠埃希菌O157∶H7多重PCR检测方法.方法 利用大肠埃希菌O157∶H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE设计2对引物,并对Palm PCR G1-12退火温度、循环数、引物浓度及引物佳比例进行优化,建立微量快速检测大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行验证.取疑似病牛粪便共9份,利用粪便DNA提取试剂盒提取DNA,按照建立的PCR方法进行扩增,扩增产物经微型电泳仪电泳检测并照相.结果 确定大肠埃希菌O157∶H7 PCR的佳退火温度为54℃,循环数为25个循环,上下游引物浓度为10 μmol/L,2对引物适比为fliCh7∶rfbE=1∶3.大肠埃希菌O157∶H7扩增产物可见625 bp(fliCh7)和213 bp (rfbE)的特异性片段,而大肠埃希菌(ATCC25922)、猪链球菌2型、金黄葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、小肠耶尔森菌、单增李斯特菌、沙门菌的PCR检测结果均为阴性,低扩增DNA浓度为10 pg/μl,重复扩增5次均可见目的条带.9份疑似病牛粪便样品中,共检测出7份大肠埃希菌O157∶H7阳性样品.结论 建立了大肠埃希菌O157∶H7微量快速多重PCR检测方法,该方法特异性、灵敏性和重复性均良好,可在现场约1h报告结果,对突发性传染病的防治具有重要意义.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 多重PCR -
基于夹心法的DNA生物传感器用于检测大肠埃希菌O157:H7 stx2基因
目的 构建DNA生物传感器用于大肠埃希菌O157:H7的快速检测.方法 基于双探针夹心法,结合酶标生物电催化反应技术和计时电流的电化学法检测大肠埃希菌O157:H7的stx2基因.结果 在佳反应条件下,DNA探针能较好地固定于金电极表面;探针标记链酶亲合素后,检测信号明显增强.DNA生物传感器具有良好的特异性,其值可达6.25×10-8mol/L.结论 构建的DNA生物传感器特异性和灵敏度高,可为大肠埃希菌O157:H7的快速检测提供新的方法.
关键词： DNA传感器 夹心法 大肠埃希菌O157∶H7 -
阀控多通道微流控芯片高通量快速检测大肠埃希菌O157∶H7
目的 建立一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157∶H7.方法 采用集成多条反应通道和控制气阀的微流控芯片,用气阀控制芯片通道内反应的顺序,在通道交叉处构建出10个检测区.然后以免疫荧光技术为检测手段,检测水和粪便标本中的大肠埃希菌O157∶H7.结果 成功建立了一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,并应用于大肠埃希菌O157∶H7的快速检测.此芯片一次可同时检测10个样本,单个样本检测时间少于10min、试剂消耗量仅为0.5 μL,对大肠埃希菌O157∶H7的低检测限为1×103 CFU/mL.检测大肠埃希菌O157∶H7组的荧光信号(4 122±164)与大肠埃希菌ATCC 25922(2.67±0.45)及伤寒沙门菌(3.33±0.94)比较,差异有统计学意义(t分别为35.78和30.79,P均＜0.01).批内精密度为5.2％.将本法用于模拟临床样品中大肠埃希菌O157∶H7的测定,敏感性和特异性分别为62％和100％,与培养法的总体符合率为81％.结论 基于气阀控制的多通道微流控芯片系统可实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157∶H7,有望成为一种高效和快捷的新检测方法.
关键词： 微流控芯片 大肠埃希菌O157∶H7 快速检测 高通量 -
应用免疫磁珠分离法及荧光定量 PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7
目的 建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(real-time PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法.方法 根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR 检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析.结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102 CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h.结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查.
关键词： 免疫磁珠分离法 荧光定量PCR 大肠埃希菌O157∶H7 -
非O157产志贺毒素大肠埃希菌研究进展
产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类能产生一种或一种以上志贺毒素的大肠埃希菌的总称,包括400余种血清型,其中以O157∶H7血清型为主.近年来,非O157 STEC在世界范围内引起散发感染和暴发的报道明显增加,但由于非O157 STEC血清型多样,菌株间表型差异较大,目前尚无一种有效的能用于所有非O157 STEC菌株分离的方法,因此非O157 STEC的流行情况可能被低估.本文就非O157 STEC的病原学、致病机制、流行病学特征、实验室诊断、治疗和预防等方面的研究进展做一简要综述.
关键词： 产志贺毒素大肠埃希菌 大肠埃希菌O157∶H7 志贺毒素 -
基于量子点和磁珠的大肠埃希菌O157∶H7检测研究
目的 构建一种基于量子点和磁珠的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法.方法 以亲和素化磁珠结合生物素化的抗体制备修饰有大肠埃希菌O157∶H7抗体的磁珠,该磁珠可从检测体系中捕获大肠埃希菌O157∶H7,依次加入生物素化大肠埃希菌O157∶H7抗体、亲和素化CdSe量子点后,分别经磁分离弃去未结合的分子,通过溶液的荧光吸收光谱的改变定量检测该菌.结果 该方法特异性好,只有大肠埃希菌O157∶H7呈阳性反应,其余对照菌株均无明显反应;随着大肠埃希菌O157∶H7浓度的增大,655 nm处荧光值也逐步升高;并在1h内实现对104 cfu/ml的菌液的检测.结论 本实验建立的这种方法检测时间短,结果易于判断,具有良好的临床应用前景.
关键词： 量子点 磁珠 大肠埃希菌O157∶H7 荧光 -
长沙市岳麓地区大肠埃希菌O157∶H7宿主动物带菌情况调查
目的:调查湖南省长沙市岳麓地区不同乡镇大肠埃希菌O157:H7宿主动物带菌情况.方法:2011年5月采集长沙市岳麓地区境内鸡、鸭、猪、牛等家畜家禽的粪便标本307份,按国标常规培养法检测大肠埃希菌O157:H7.并采用PCR对分离菌株O157的抗原特异性基因rfb EO157进行检测.结果:307份标本中共检出阳性标本6份,总阳性率为1.95％(6/307),其中散放的鸡、鸭、猪带菌阳性率分别为1.67％(3/180)、14.29％(1/7)、2％(2/100).且分离的6株大肠埃希菌O157:H7特异性基因rfb EO157均为阳性.结论:长沙市岳麓地区家畜家禽已存在大肠埃希菌O157:H7感染,应引起足够的重视.提示加强宿主动物大肠埃希菌O157:H7监测,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 宿主动物 岳麓地区 带菌情况 调查 -
用低检出限评价大肠埃希菌O157∶H7的检测方法及应用研究
目的 用低检出限评价大肠埃希菌O157∶H7的三种检测方法,在突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查中,将大肠埃希菌O157∶H7的检测方法有机组合,提高检测的速度、灵敏度. 方法 将标准菌株10倍稀释,制备模拟样品,用大肠埃希菌O157∶H7的三种方法进行检测,比较不同检测方法的低检出限. 结果 标准菌株10倍稀释改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的低检出限分别为103、100、102 cfu/ml；模拟样品中增菌前改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的低检出限分别为105、101、104cfu/ml,增菌培养后改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的低检出限分别为102、100、100 cfu/ml. 结论 免疫磁珠分离法在增菌前和增菌培养后的检出限为低,增菌培养后实时荧光PCR法的检出限也达到了低,适用于食物中毒及食源性疾病的快速诊断.用改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法进行检测,易造成漏检.将免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法有机组合,可以大大提高检测的速度,灵敏度,并且可获得菌株.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 最低检出限 检测方法 -
大肠埃希菌O157∶H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测
目的 了解大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况.方法 将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列(API-20E)和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定.应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2(SLT1/SLT2)和侵袭相关基因.小白鼠腹腔注射法测定其毒力.K-B法做抗生素药敏试验.结果 从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157∶H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因.毒力试验使小白鼠发病死亡.药敏试验对14种抗生素敏感.结论 云南战区存在EHEC O157∶H7感染.建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157∶H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 免疫磁珠 多重PCR 毒素基因 -
市售肉制品中检出四川省首例有动力O157∶H7
目的 通过对2009-2011年市辖区内食源性致病菌监测数据的统计,及时发现EHEC O157∶H7并分析原因.方法 按照国家相关标准方法进行检测.结果 检出四川省首例有动力O157∶H7.结论 四川省已存在EHEC O157∶H7引起食物中毒的危险性.各级食品安全监管及检验部门对此应高度重视,预防该菌在四川省的传播和食物中毒的暴发.
关键词： 肉制品 动力 大肠埃希菌O157∶H7 -
基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测
目的 基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法.方法 应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列.使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列.Clustal X软件进行间隔序列比对.比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性.结果 共分析543株肠道细菌,其中75.6％的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5％志贺菌、91.7％沙门菌和95％O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3.57.1％的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6％志贺菌、85.4％沙门菌和100％ O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个.95％的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90％ CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1,S1-2,S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1).间隔序列比对结果显示,S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100％和99.6％.标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6％和99.3％.基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3 CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来.大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类.结论 基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具.
