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潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌的筛查
目的 筛查具有潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌.方法 对从河南省睢县分离到的36株弗氏枸橼酸杆菌进行黏附HEp-2细胞的检测,以及与HEp-2细胞(MOI:100)作用10 h后的乳酸脱氢酶(LDH)释放情况分析.同时比较弗氏枸橼酸杆菌CF74(Citrobacter freundii 74)、CF72(Citrobacter freundii 72)、肠聚集性大肠埃希菌(EnteroaggregativeE.coli,EAEC)、肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)2348/69和HB101的黏附和细胞毒性差异.结果 16株弗氏枸橼酸杆菌几乎没有黏附性,黏附指数＜1;18株弗氏枸橼酸杆菌具有中等强度的黏附性,黏附指数＜100;2株弗氏枸橼酸杆菌CF74和CF65(Citrobacter freundii 65)具有强的黏附性.与HEp-2细胞作用10 h后,除了CF74(24.4％),其余的35株弗氏枸橼酸杆菌具有低的LDH释放量,LDH释放量与阴性对照HB101 (5.02％)相似.说明除了CF74,其余的弗氏枸橼酸杆菌不具有细胞毒性.CF74具有和EAEC042一样的聚集性黏附类型,并且CF74引起的LDH释放率明显高于CF72、2348/69和HB101(P＜0.01)而低于EAEC17-2.结论 作为潜在的致病菌,CF74具有强的黏附性和细胞毒性.
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弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法的建立
目的 建立针对弗氏枸橼酸杆菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法.方法 针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度；对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性；使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性.结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0×101拷贝/反应体系；该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增.该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0×102cfu/ml的菌量；通过对1.0×107、1.0×105和1.0×103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90％～3.91％；组间变异系数为1.52％ ～ 1.69％.结论 本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法.
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一种鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌的PCR方法
目的 利用基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法,鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌和O157大肠埃希菌.方法 用微生物鉴定仪对细菌进行生化鉴定,与P157血清凝集,同时扩增wzx基因.结果 25株与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌及1株不与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阳性,8株与O157血清不凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阴性,20株O157:H7大肠埃希菌wzx基因扩增为阴性.结论 对于可与O157血清发生强凝集的弗氏枸橼酸杆菌,基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法是一种有效的快速鉴别方法.
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弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌
目的 研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能.方法 构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74△T6SS).对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74△T6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析.结果 在CF74△T6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且FliC的表达下调十分明显;在CF74△T6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且FliC、FlgK和FliD的表达下调十分明显.结论 弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响FliC蛋白的表达和分泌.
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65株弗氏枸橼酸杆菌的鉴定分析
枸橼酸杆菌属条件致病菌,可引起原发和不同程度的继发感染,如呼吸道、泌尿感染及败血症等,占医院感染的1.5%.枸橼酸杆菌对抗生素敏感性不同,为了解其对日常临床常用抗生素耐药发生频率和监测其耐药性发展,为临床医生正确选择及合理使用抗生素提供依据,作者对65株弗氏枸橼酸杆菌进行了药敏实验,现将检出结果及鉴定体会报道如下.
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弗氏枸橼酸杆菌引起的急性坏死性小肠炎1例报道
1999年11月30日我们从1例患有急性坏死性小肠炎的女患者腹腔引流液及术后回肠、回盲部溃疡面积的分泌物中分离出C.freundii(弗氏枸橼酸杆菌).该菌在血平板,SS,麦康凯及巧克力等平皿上均生长,菌落呈灰白色,中等大小,湿润,SS平皿上产H2S.革兰染色为革兰阴性菌,周身鞭毛,氧化酶(-),将其接种肠杆菌科生化编码鉴定管,结果尿素(-),苯丙氨酸(-),硫化氢(+),发酵葡萄糖产酸产气,乳糖(+),赖氨酸脱羧酶(-),鸟氨酸脱羧酶(+),运动性(+),靛基质(-),柠檬酸盐(+),VP(-),DNA酶(-),甲基红(+),丙二酸盐(+),棉子糖(+),L-鼠李糖(-),麦芽糖(+),纤维二糖(-),硝酸盐还原(+),酒石酸盐(+),参照<全国临床检验操作规程>中肠杆菌科的鉴别及生化编码,此菌为弗氏枸橼酸杆菌.因其分解乳糖,且沙门氏菌血清型鉴定为阴性,从而将此菌与沙门菌区分开.
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弗氏枸橼酸杆菌CF74的FliS蛋白功能研究
目的 研究弗氏构橼酸杆菌CF74的FliS蛋白功能.方法 构建弗氏枸橼酸杆菌CF74 fliS的精确缺失突变株(CF74△fliS)及其互补菌株(CF74pfliS),并进行细菌游动性实验,检测它们对THP1细胞的粘附性和细胞毒性的作用.并用Western blotting方法检测FliC蛋自在培养上清中的分泌.结果 弗氏构橼酸杆菌CF74△fliS突变株没有游动性,而回补株CF74pfliS回补了游动性.而且,CF74△fliS突变株降低对THP1细胞的粘附和细胞毒作用,其回补株恢复了粘附性和细胞毒性.此外,CF7 4△ fliS突变株降低FliC蛋白在培养上清中的分泌.结论 FliS蛋白影响弗氏构橼酸杆菌CF74的游动性,并参与其对宿主细胞的粘附和细胞毒作用.
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弗氏枸橼酸杆菌脂多糖突变株发生鞭毛合成异常
目的探讨弗氏枸橼酸杆菌群集运动的分子机制.方法用Mini-Tn5 Km转座子诱导获得弗氏枸橼酸杆菌群集运动突变株;通过反向PCR扩增突变基因并测序,从而确定发生突变的基因;观察突变株的运动和形态等特征.结果研究表明有7株突变株涉及3个与脂多糖合成有关的基因突变,分别为wzxB、waaW、waaL,导致弗氏枸橼酸杆菌群集运动能力显著下降.同时,这些突变株的鞭毛合成也出现异常,即培养的细菌中仅有小部分呈现正常的鞭毛合成,而大多数菌体聚集在一起,且鞭毛合成呈抑制状态,电镜观察发现多数聚集的菌体没有鞭毛或只有很少的鞭毛.与之相对应的是,野生株没有这个现象.结论脂多糖结构的缺失影响弗氏枸橼酸杆菌鞭毛的生成,进而影响其群集运动能力.
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利用Mini-Tn5转座子诱导弗氏枸橼酸杆菌插入突变的研究
目的研究以自杀性质粒pUT携带的Mini-Tn5转座子对弗氏枸橼酸杆菌进行转座诱变.方法转座采用双亲本接合法,对获得的接合子进行无抗性选择条件下的连续传代测定其稳定性,并测其氨苄青霉素耐性及进行质粒提取以排除质粒传代原因造成假阳性的可能.对接合子进行营养缺陷株和运动突变株的筛选.结果Mini-Tn5 Km转座率约为每受体菌9.2× 10-6,接合子在无抗性选择的情况下培养3代仍保持稳定,卡那霉素抗性不消失,说明插入到染色体上的转座序列是稳定传代的.接合子的抗性是染色体而非质粒编码的结果.对营养缺陷株的筛选和分析提示,转座子的插入是随机的,弗氏枸橼酸杆菌染色体中无明显的转座插入热区.使用该转座子能有效筛出运动突变株.结论Mini-Tn5系列转座子适于大规模筛选弗氏枸橼酸杆菌突变株.
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转座突变株插入位点侧翼序列的研究
目的 比较用于扩增弗氏枸橼酸杆菌转座突变株插入位点侧翼序列的3种PCR方法,以选择有效、简便的扩增方法进行转座突变基因的分析.方法分别采用step-out PCR、随机引物巢式PCR和反向PCR对弗氏枸橼酸杆菌转座突变株基因组中插入位点的侧翼序列进行扩增,并取产物进行直接测序,以对方法的有效性进行比较.结果随机引物巢式PCR方法简便,但扩增产物的条带较多,不利于后续的测序操作.Step-out PCR产物中非特异性片段更多,方法不可取,反向PCR法为简便有效.结论 反向PCR法适宜用于扩增弗氏枸橼酸杆菌转座突变株插入位点的侧翼序列,可以对突变基因进行定位.
