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多伞阿魏体外抗胃癌活性筛选、细胞凋亡及周期阻滞机制
目的:研究确定新疆特色维族药多伞阿魏体外抗胃癌活性部位及其敏感胃癌细胞系,并探讨多伞阿魏诱导胃癌细胞凋亡和细胞周期阻滞情况,为其进一步在抗胃癌方面的研究、开发与应用提供实验依据.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同质量浓度多伞阿魏不同提取物(挥发油,95％乙醇提取物,及其石油醚部位,三氯甲烷部位,乙酸乙酯部位,正丁醇部位,水部位)分别对5种胃癌细胞系(AGS,MKN-45,BGC-823,MGC-803,SGC-7901)的增殖抑制作用;采用Hoechst33258荧光染色法观察多伞阿魏挥发油和三氯甲烷部位对胃癌细胞AGS和SGC-7901的影响情况;并应用细胞流式仪检测多伞阿魏不同提取部位作用胃癌细胞AGS和SGC-7901的凋亡和周期阻滞影响情况.结果:与空白组比较,多伞阿魏挥发油,95％乙醇提取物,石油醚部位,三氯甲烷部位,乙酸乙酯部位对5种胃癌细胞均有不同程度的增殖抑制作用(P<0.05),并呈现浓度依赖关系.挥发油对胃癌细胞AGS呈现出较强的增殖抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)为(7.98 ± 2.62)mg·L-1,三氯甲烷部位对5种胃癌细胞系均具有较好的敏感性,对胃癌细胞SGC-7901为敏感,其IC50为(8.73 ± 0.55)mg·L-1,而正丁醇部位和水部位未呈现出明显的细胞增殖抑制作用;多伞阿魏挥发油和三氯甲烷部位作用胃癌细胞AGS和SGC-7901后,细胞核被Hoechst33258染色呈亮蓝色,且随着药物浓度的增加蓝色荧光越强;流式细胞凋亡检测结果显示,多伞阿魏不同提取部位诱导胃癌细胞AGS和SGC-7901发生不同程度的凋亡(P<0.05),且随着药物浓度的增加,细胞总凋亡率明显增高;流式细胞周期检测结果显示,与空白组比较,多伞阿魏挥发油使胃癌细胞AGS的周期发生明显改变,细胞休眠期/DNA复制前期(G0/G1期)细胞比例增高,DNA复制期(S期)细胞比例降低,DNA复制后期/有丝分裂期(G2/M期)比例降低(P<0.05);与空白组比较,多伞阿魏三氯甲烷部位使胃癌细胞SGC-7901的周期也发生显著改变,G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增高,G2/M期比例降低(P<0.05).结论:多伞阿魏挥发油对胃癌细胞AGS呈现出较强的细胞毒活性,三氯甲烷部位对5种胃癌细胞均具有较好的增殖抑制作用,尤其对胃癌细胞SGC-7901 为敏感;多伞阿魏各提取部位诱导胃癌细胞AGS和SGC-7901主要发生晚期凋亡,而多伞阿魏乙酸乙酯部位诱导胃癌细胞AGS主要发生细胞早期凋亡;多伞阿魏挥发油能够将胃癌细胞AGS阻滞于G0/G1期,阻止细胞进入S期及G2/M期;伞阿魏三氯甲烷部位将胃癌SGC-7901细胞周期阻滞于S期.研究表明多伞阿魏挥发油和三氯甲烷部位具有较好的抗胃癌活性作用,具有潜在的研究价值和开发利用空间,并为多伞阿魏体内抗胃癌及其抗胃癌机制研究提供了一定的科学依据.
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新疆民族药多伞阿魏挥发油成分与遗传多样性相关性研究
目的:通过对多伞阿魏挥发油成分与其遗传多样性相关性研究,为多伞阿魏种质资源与品质评价提供重要科学依据.方法:测定不同产地多伞阿魏挥发油成分含量,采用ISSR分子标记技术和聚类分析对来自省内8个县的176份多伞阿魏样品的遗传多样性进行研究,运用灰色关联法分析多伞阿魏遗传多样性对挥发油成分含量的影响.结果:用所筛选的15条引物对多伞阿魏样品进行ISSR分析,共扩增出126条清晰的条带,其中多态性位点93个.8个居群中遗传多样性水平高的是裕民县[多态性位点百分率(PPB)=29.37％,Nei's多样性指数(H) =0.1104,Shannon's信息指数(I)=0.164 3)],低的是青河县(PPB＝19.05％,H＝0.070 5,I=0.105 4).其中沙湾县与富蕴县的多伞阿魏居群间遗传距离大(0.219 9),两者的遗传一致度低(0.802 6),表明两者之间的亲缘关系远,遗传差异较大.由H,I,PPB计算的多伞阿魏居群间的遗传多样性与人参新萜醇、龙脑、γ-桉叶油醇及挥发油成分总含量关联性较大.结论:多伞阿魏居群间的遗传变异为63.08％,居群内的遗传变异为36.92％,多伞阿魏地理分布与遗传多样性具有显著关系,多伞阿魏3个遗传多样性因子中的Nei's多样性指数对多伞阿魏挥发性成分含量有着较大的影响.
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UPLC测定多伞阿魏中倍半萜烯香豆素(DAW22)的含量
目的:利用超高效液相色谱法测定了分布于新疆的不同生长时期多伞阿魏中DAW22的含量.方法:采用固相萃取(SPE)净化,测定条件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50mm,1.7μm),以甲醇-1％甲酸水溶液为流动相,进行梯度洗脱,流速0.2 mL·mL-1,柱温30℃,波长316 nm,进行含量测定.结果:DAW22进样量在6.21～124.2 ng(r=1.000 0)与其峰曲线下面积呈良好的线性关系,平均回收率99.81％,RSD 2.0％,生长在5月9日的多伞阿魏植株中DAW22的含量高.结论:建立的多伞阿魏中DAW22的质量控制研究方法准确、可靠、重复性好,能够用于多伞阿魏的质量控制.
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维药多伞阿魏中总黄酮提取工艺研究及含量测定
目的:研究新疆多伞阿魏中总黄酮的提取工艺及含量测定方法.方法:分别采用紫外可见分光光度法考察超声波提取和回流热浸提法正交提取实验对阿魏总黄酮含量的影响,来确定提取多伞阿魏总黄酮的佳工艺条件.结果:回流热浸提取多伞阿魏中总黄酮的佳工艺为乙醇浓度为80％,70℃回流提取60min,得黄酮含量为29.45mg/g.超声波提取法优工艺为80％乙醇超声提取2次,每次60min,黄酮含量为28.39mg/g.结论:两种提取工艺和含量测定方法科学可行,可用于阿魏的质量控制,但超声提取法较回流法操作简便.
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多伞阿魏与阿魏的初步定性研究
目的:介绍阿尔泰多伞阿魏,并与药典收载阿魏品种进行比较实验.方法:薄层色谱鉴别.结果:以上两种不同药材在TLC色谱中所显的斑点相同.结论:实验证明两者町以相互替代使用.
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维药多伞阿魏体外抗胃癌活性部位GC-MS指纹图谱的研究
目的 初步确定多伞阿魏Ferula ferulaeoides体外抗胃癌活性部位,并对其进行GC-MS指纹图谱研究.方法 采用MTT法检测多伞阿魏不同提取物对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用;采用GC-MS、主成分分析对多伞阿魏体外抗胃癌活性部位指纹图谱进行研究.结果 多伞阿魏氯仿提取部位对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用强;建立了多伞阿魏体外抗胃癌活性部位GC-MS指纹图谱分析方法,确立了28个共有峰,与抑制胃癌细胞增殖作用有较强关系的11个共有峰,分别鉴定为峰1(3-甲氧基-1,2丙二醇)、2(右旋柠檬烯)、4(左旋乙酸龙脑酯)、6(乙酸松油酯)、7(2,6,10-三甲基-1,5,9-十一烷三烯)、8(α-柏木烯)、9(α-香柑油烯)、12(β-雪松烯)、21(8-表-γ-桉叶油醇)、22(γ-桉叶油醇)、23(茅苍术醇).10批样品中共有峰成分占总成分的92％以上,其相似度达到0.9以上.结论 初步确证了多伞阿魏氯仿提取部位具有抑制胃癌细胞SGC-7901增殖作用.建立的GC-MS指纹图谱方法快速、简便,具有良好的精密度、重复性、稳定性,可作为多伞阿魏活性部位的质量控制方法.
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多伞阿魏挥发油提取工艺及化学成分研究
目的 采用水蒸气蒸馏提取多伞阿魏挥发油,并对挥发油化学成分进行分析.方法 采用U7(72)均匀试验设计优选多伞阿魏挥发油提取工艺.GC-MS测定多伞阿魏挥发油化学成分.结果 多伞阿魏挥发油优选提取工艺为加入14倍水,提取4h,平均提取率为8.02％±0.007％.在多伞阿魏挥发油中鉴定出44种化合物,主要成分是(1R)-(+)-蒎烯(3.64％)、莰烯(4.68％)、β-蒎烯(2.28％)、3-蒈烯(4.15％)、D-柠檬烯(9.08％)、异松油烯(3.00％)、(1S,2S,4R)-醋酸-1,3,3-三甲基-双环[2.2.1]庚烯-2-醇(3.13％)、左旋乙酸冰片酯(17.78％)、(E)-β-金合欢烯(11.26％)、α-法尼烯(7.48％)、反式-橙花叔醇(6.33％)、愈创木醇(11.44％),未检出多硫化合物.结论 由于部分主成分对热不稳定,提取时间不宜超过5h.
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不同方法提取的多伞阿魏挥发油化学成分及其体外抗胃癌活性比较
目的 研究不同方法提取的多伞阿魏挥发油化学成分,并初步考察其抑制胃癌细胞SGC-7901的活性.方法 分别采用水蒸气蒸馏法、溶剂回流提取法、超声提取法、微波萃取法、微波-超声协助萃取法、渗漉提取法和超临界CO2萃取法制备多伞阿魏挥发油,用气相色谱-质谱联用法分析其化学成分;MTT比色法测定不同方法制备的多伞阿魏挥发油对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用.结果 从7种不同方法制备的多伞阿魏挥发油中共鉴定了74个化合物,只有水蒸气蒸馏法和微波萃取法制备的多伞阿魏挥发油在对胃癌细胞SGC-7901具有很强的抑制作用.结论 水蒸气蒸馏法和微波萃取法制备的挥发油均具有小分子单萜类化合物和部分苯类化合物可能是抑制胃癌细胞SGC-7901的主要原因.
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新疆民族药多伞阿魏挥发油成分与土壤因子相关性研究
目的 研究土壤因子对多伞阿魏挥发油成分的影响,筛选影响其含量的主导因子.方法 测定不同产地多伞阿魏挥发油成分含量及相应生长地土壤养分和pH值等,采用单因素方差分析、相关分析和偏小二乘法和灰色关联等统计方法分析土壤因子对多伞阿魏挥发油成分含量的影响.结果 不同产地多伞阿魏挥发油成分含量和土壤因子均有显著差异.多伞阿魏12种挥发油成分总含量与土壤pH值呈显著负相关(P＜0.05);愈创木醇与速效钾呈显著负相关(P＜0.05);α-蒎烯与土壤速效氮、速效钾呈显著正相关(P＜0.01);莰烯、右旋柠檬烯与土壤速效钾呈显著正相关(P＜0.05);异愈创木醇与全磷呈显著正相关(P＜0.05);β-金合欢烯与速效磷呈显著负相关(P＜0.05).偏小二乘法分析表明,土壤pH值、速效钾含量对多伞阿魏挥发油成分的积累具有重要意义.灰色关联分析表明,土壤pH值、含水量和速效钾与多伞阿魏挥发油成分关联度较大.结论 不同产地多伞阿魏挥发油成分含量和土壤因子均有显著差异.各土壤因子对多伞阿魏挥发油成分的影响各有不同,土壤pH值、含水量和速效钾的含量可能是影响多伞阿魏挥发油成分含量的主导因子.
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不同产地多伞阿魏挥发油成分GC-MS指纹图谱研究
目的 建立多伞阿魏药材的GC-MS指纹图谱.方法 采用水蒸气蒸馏法提取8个产地44份多伞阿魏挥发油,通过GC-MS分析其成分.运用中药色谱指纹图谱相似度建立共有模式,以2种方法计算相似度评价图谱的相似性,同时利用聚类分析法和主成分分析法分析结果.结果 建立了多伞阿魏挥发油GC-MS指纹图谱分析方法;对44份多伞阿魏挥发油样品进行了分析,确立了12个共有峰.GC-MS指纹图谱的相似度＞0.90的有37个.44份多伞阿魏药材的挥发油可通过系统聚类归为2类,该结果与指纹图谱的相似度分析结果非常相似,不同产地多伞阿魏药材的挥发油相似度较高.主成分分析表明愈创木醇在多伞阿魏挥发油的质量控制中起着比较重要的作用.结论 该方法简便、准确、重现性好,可用于多伞阿魏药材的质量综合评价.
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多伞阿魏的鉴别研究
对新疆地产多伞阿魏进行生药学鉴定研究.方法:采用性状、显微和薄层鉴别法为该药进行初步鉴定研究,并确立其鉴别特征.结果:多伞阿魏根、茎及叶的横切面中存在大量椭圆形的树脂道,大直径可达10μm；粉末中观察到非腺毛、石细胞、草酸钙方晶、网纹导管和螺纹导管等.薄层色谱中,供试品与阿魏酸对照品相应的位置上,显相同颜色的斑点.结论:本研究结果可为多伞阿魏的鉴别和质量标准的制订提供参考依据.
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多伞阿魏简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立和优化
目的:建立并优化多伞阿魏简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系.方法:通过单因素试验确定影响多伞阿魏ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板佳水平范围.对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素4水平的正交试验,优选佳ISSR-PCR体系条件.ISSR-PCR扩增结果用SPSS 18.0统计软件分析.结果:不同水平的因素对PCR均有明显影响,其中Mg2+、dNTPs、引物影响大.多伞阿魏ISSR-PCR佳反应体系为:在50μl的反应体系中含有10×Taq Buffer 5 μl、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.4 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.75 u/50μl、DNA模板0.25 ng/μl.在此基础上,从100条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论:建立的多伞阿魏ISSR-PCR体系具有较高的稳定性和重现性,可为进一步利用ISSR技术进行多伞阿魏遗传多样性分析、不同种源鉴定及亲缘关系分析提供基础.
关键词： 多伞阿魏 简单重复序列区间-聚合酶链反应体系 单因素试验 正交试验
