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橄榄苦苷对胰岛素抵抗HepG2肝细胞胰岛素信号传导的影响
目的:观察橄榄苦苷(oleuropein,OL)对胰岛素抵抗HepG2肝细胞的胰岛素信号传导的影响.方法:常规复苏细胞,于10％ FBS+ 1％青-链霉素的DMEM(1 g·L-1葡萄糖)培养基中,37℃5％ CO2细胞培养箱中培养,常规细胞培养传至第3代待用;利用1×10-6mol· L-1胰岛素溶液刺激HepG2肝细胞36 h后建立肝细胞胰岛素抵抗模型,分为模型组,OL组(50 μmol·L-),另设正常HepG2肝细胞为正常组,每组设6个复孔;对数生长期细胞,饥饿培养24 h后,诱导建立胰岛素抵抗模型,进行药物干预36 h后,以细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测OL对细胞活性的影响;OL对胰岛素抵抗HepG2肝细胞干预后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测肝细胞胰岛素受体(InsR),胰岛素受体底物-1(IRS-1),葡萄糖转运蛋白-2(GLUT-2)mRNA和蛋白表达水平.结果:与正常组比较,模型组胰岛素抵抗的HepG2肝细胞活性明显降低(P＜0.05),胰岛素信号分子InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.05,P＜0.01).与模型组比较,OL干预后胰岛素抵抗的HepG2肝细胞活性显著升高(P＜0.01);胰岛素信号分子InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白表达明显升高(P ＜0.05,P＜0.01).结论:OL能够增加胰岛素抵抗肝细胞活性,上调肝细胞胰岛素信号通路中InsR,IRS-1,GLUT-2 mRNA和蛋白的表达,这可能是其改善胰岛素抵抗的机制之一.
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大黄素通过激活PPARγ促进HepG2细胞葡萄糖摄取
目的 构建PPARγ和PPARγ应答元件(PPRE)荧光素酶系统,并确定大黄单体成分大黄素是否能够通过激活PPARγ促进HepG2肝细胞葡萄糖摄取.方法 (1)构建PPARγ和PPRE荧光素酶系统并对20余种中药成分进行筛选;(2)将能够激活PPARγ和PPRE系统的大黄素与HepG2肝细胞进行培养,分别用RT-PCR/Southern杂交测定PPARγmRNA的表达;(3)用Western印迹法测定大黄素处理后的HepG2细胞的PPARγ和葡萄糖转运蛋白2(Glut2)的表达水平;(4)测定大黄素作用后的HepG2细胞对2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖摄取率.结果 (1)在筛查的中药成分中,大黄素作用24 h后,呈剂量(0.04～180 μmol/L)依赖性地增强COS-7细胞PPRE荧光素酶活性,其中90 μmol/L浓度时达到高值,为对照组的4倍(P＜0.01),而10μmol/L浓度的吡格列酮作用强度为对照组的6倍(P＜0.01);(2)大黄素在90μmol/L浓度时刺激HepG2细胞PPARγmRNA表达水平增加2.7倍(P＜0.01);(3)大黄素的作用呈剂量和时间依赖性地刺激HepG2细胞PPARγ和Glut2蛋白的表达水平.其中,PPARγ蛋白水平在90 μmol/L和作用16 h刺激作用强,约为对照组的3.1～3.8倍(P＜0.01);Glut2蛋白水平在90μmol/L和作用16 h刺激作用强,约为对照组的2.5～4.3倍(P＜0.01);(4)HepG2细胞的葡萄糖摄取率在90μmol/L浓度的大黄素作用24 h后,约为对照组的5倍(P＜0.01).结论 研究结果显示大黄素刺激HepG2肝细胞PPARγ和Glut2蛋白表达,并促进葡萄糖的摄取.
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rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP转染HepG2肝细胞对125I-HDL摄取的调节
[目的]探讨B族I型清道夫受体(SR-BI)过表达对高密度脂蛋白(HDL)摄取的调节,为SR-B1在胆固醇逆转运(RCT)及动脉粥样硬化(AS)中的研究提供新思路.[方法]用含SR-BI基因的重组腺相关病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体转染人HepG2肝细胞株,Reahime RT-PCR和Western Blot分别检测转染后SR-BI mRNA和蛋白的表达.125I-HDL同位素标记观察转染对HDL结合的影响.激光共聚焦显微镜观察转染后SR-BI细胞分布及转移情况.[结果]与未转染组及对照病毒rAAV2/1-IRES-EGFP转染组相比,重组病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP转染组SR-BI mRNA水平和蛋白表达显著增加,差别均有统计学意义(P均＜ 0.01),且可以引起125I标记的HDL与HepG2肝细胞的结合增加1.28倍和1.40倍,差别均有统计学意义(P均＜0.01).在无血清状态下,我们用激光共聚焦显微镜观察发现SR-BI同时位于细胞膜和细胞浆,HDL可以促进SR-BI从细胞浆到细胞表面的转移.[结论]SR-BI过表达可以增加HepG2肝细胞HDL的摄取且摄取可能主要发生在细胞膜上,SR-BI参与了RCT的过程.
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重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体基因腺相关病毒血清型2/1杂合载体在HepG2肝细胞的表达
[目的]构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在HepG2肝细胞的表达.[方法]以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA,将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中,经酶切及测序鉴定后,脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株,用携带rep2-capl基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株.通过细胞孵育、裂解和病毒纯化,得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒.免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达,计算转染效率,Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达.[结果]酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体.转染HepG2肝细胞后免疫荧光显微镜检测佳MOI值为1×10~5时,以此值转染HepG2肝细胞荧光高效表达:Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组HepG2肝细胞均有SR-BI蛋白表达,rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加.[结论]成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统,转染后SR-BI蛋白在HepG2肝细胞高效表达,为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础.
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色素上皮衍生因子对人HepG2肝细胞脂代谢的影响
目的:探讨色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)对人HepG2肝细胞脂代谢的影响.方法:分别用重组人PEDF细胞因子和PEDF抗体干预HepG2肝细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测脂质合成和分解的关键酶mRNA及蛋白水平的变化；裂解细胞后用酶法测定细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量.结果:(1)PEDF干预人HepG2肝细胞后,固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element-binding proteinl,SREBP1)、脂肪酸合成酶(Fatty acid syn-thase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl coenzyme A carboxylase1,ACC1)、羟甲基戊二酰辅酶还原酶(HMG-coAreductases,HMGR)mRNA的表达较正常对照分别降低39％、38％、61％、32％(P＜0.05),而脂肪甘油三酯脂酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)的表达增加了98％(P＜0.05)；用PEDF抗体干预后,SREBP1、FAS、ACCI、HMGRmRNA的表达分别较正常对照增加92％、56％、67％、42％(P＜0.05),ATGL的表达则减少了51％(P＜0.05).(2)在蛋白水平,PEDF干预后FAS、ACC1、HMGR表达较正常组分别减少58％、54％、43％,而ATGL的表达增加20％(P＜0.05)；用PEDF抗体干预后,FAS、ACC1、HMGR表达较正常组分别增加41％、39％、48％,而ATGL的表达减少40％(P＜0.05).(3)PEDF的干预使细胞内TG明显减少[(410.40±13.43)mg/gvs.(234.70±35.70)mg/g,P＜0.05],而PEDF抗体干预后,细胞内TG含量有上升趋势,但无统计学差异[(410.40±13.43)mg/gvs.(440.32±25.67)mg/g,P=0.67].结论:PEDF在HepG2肝细胞中可抑制脂肪酸的合成,并促进脂肪分解,从而降低细胞内TG的含量.
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TNF-α促进HepG2肝细胞脂质积聚及其机制的初步研究
目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是否能够促进肝细胞脂质积聚,并对其机制进行初步探讨.方法 将HepG2肝细胞分为空白对照组、单纯TNF-α组(TNF-α 2 ng/mL或20 ng/mL)、软脂酸组(软脂酸0.08 mmol/L或0.2 mmol/L)及联合组(TNF-α2 ng/mL联合软脂酸0.08 mmol/L、TNF-α 2 ng/mL联合软脂酸0.2 mmol/L、TNF-α 20 ng/mL联合软脂酸0.08 mmol/L、TNF-α 20 ng/mL联合软脂酸0.2 mmol/L),处理24h,应用化学酶促-比色法定量检测细胞内TG含量.进一步选取TNF-α 20 ng/mL和软脂酸0.08 mmol/L,通过油红O染色观察HepG2细胞内脂质积聚情况；实时荧光定量PCR和Western blot检测HepG2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的表达水平.结果 ①单纯TNF-α组TG含量[TNF-α 2 ng/mL组(0.344±0.093) μg/μg、TNF-α20 ng/mL组(0.329±0.068) μg/μg]分别较空白对照组[(0.192 ±0.048) μg/μg]显著升高(P＜0.05)；联合组[TNF-α 2 ng/mL联合软脂酸0.08 mmol/L组(0.451±0.096) μg/μg、TNF-α 2 ng/mL联合软脂酸0.2 mmol/L组(0.821 ±0.257) μg/μg、TNF-α 20 ng/mL联合软脂酸0.08 mmol/L组(1.032±0.286) μg/μg、TNF-α 20 ng/mL联合软脂酸0.2 mmol/L组(2.134±1.049)μg/μg]分别较软脂酸组[软脂酸0.08 mmol/L 组(0.247±0.069) μg/μg、软脂酸0.2 mmol/L组(0.341 ±0.031) μg/μg]显著升高(P＜0.05)；②油红0染色进一步显示,TNF-α促进肝细胞内脂质积聚.③实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示单纯TNF-α组与空白对照组相比,HepG2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的表达均增加(P＜0.05)；联合组与软脂酸组相比,肝细胞内SREBP-1、FAS、ACCα的表达水平明显上调(P＜0.05).结论 TNF-α促进HepG2肝细胞内脂质积聚,增加SREBP-1、FAS、ACC α的表达.
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阪崎肠杆菌培养蛋白对乳鼠肝组织及HepG2肝细胞损伤的实验研究
目的 分析阪崎肠杆菌培养产物中粗提蛋白质对乳鼠肝组织的损伤作用,探索阪崎肠杆菌新的致病因子.方法 采用酪蛋白氨基酸酵母浸膏培养液(CAYE)培养基培养阪崎肠杆菌,饱合硫酸铵沉淀法粗提培养上清;纯化后的上清蛋白质以0.1 μg/100 μL 浓度给予乳鼠灌胃,无菌取肝组织,制作病理切片并染色,镜下分析肝组织病理变化特征;以相同浓度的粗提蛋白质体外侵袭HepG2肝细胞,观察细胞生长变化情况.结果 阪崎肠杆菌经隔夜培养,从其培养上清中纯化得到分子量为69 kDa蛋白质,以0.1 μg/100 μL浓度对乳鼠灌胃,病理切片分析表明乳鼠肝组织呈现点状坏死特征;侵袭的HepG2肝细胞形态发生变化,并伴有大量细胞死亡.结论 从阪崎肠杆菌培养上清中分离纯化的蛋白质,在体内和体外条件下均可对肝细胞产生损伤,推测该蛋白质具生物活性,在一定条件下能够对机体产生损伤,可能在阪崎肠杆菌致病过程中起到重要作用.
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阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起HepG2肝细胞的基因表达变化
目的:通过高通量测序法分析阪崎肠杆菌培养上清蛋白引起HepG2肝细胞的基因表达变化,并探讨阪崎肠杆菌致病作用的分子机制.方法:采用CAYE培养基培养阪崎肠杆菌,硫酸铵沉淀法及膜透析法分离纯化上清蛋白;分别在1×106/mL的HepG2肝细胞培养液中加入终浓度为1.6 μg/mL的上清蛋白稀释液及蒸馏水作为实验组和对照组,提取细菌总RNA;构建文库并运用illumina测序平台测序,分析两组间的基因表达差异,采用Gene Ontology(GO)富集分析和Pathway分析了解差异表达基因的功能;荧光定量PCR(qPCR)验证RPS18、RFC4基因差异表达结果.结果:高通量测序结果显示,与对照组相比,实验组HepG2细胞存在5 120个差异表达基因,其中上调2 155个,下调2 965个;GO富集分析显示差异基因主要参与细胞核分裂、有丝分裂、复制等多个生物学过程,Pathway分析显示差异基因主要与DNA复制、蛋白转运、精氨酸和脯氨酸代谢等有关;qPCR验证结果与高通量测序结果一致.结论:阪崎肠杆菌培养上清蛋白能够引起HepG2肝细胞RPS18、RFC4等基因的表达变化,并可能与核糖体变化和/或DNA复制与修复有关.
