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传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选
目的:运用计算机虚拟筛选技术从传统中药数据库(TCM database@Taiwan)中快速搜索H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的中药小分子抑制剂.方法:采用AutoDock Vina软件对蛋白质晶体结构数据库PDB中NA与小分子抑制剂扎那米韦形成的复合物(PDB代码为4MWX)三维结构活性部位进行分析,基于传统中药配体库进行分子对接初次筛选.综合运用传统中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP及Accelrys公司开发的Discovery Studio 2.5分子模拟软件包内TOPKAT模块计算药代动力学参数和毒性预测对分子对接结果进行2次筛选.结果:以原配体(扎那米韦)的自由结合能为阈值,筛选出中国传统中药数据库中3个类药性良好的化学成分与NA亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦的天然小分子化合物,并且确定了它们的中草药来源.结论:该研究结果可促进从传统中药库中提取、设计及实验合成新抗H7N9流感病毒药物.
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H7N9流感病毒感染A549细胞蛋白质组学的初步研究
通过建立H7N9和H1N1流感病毒(H1N1pdm09)感染人肺癌上皮细胞(A549)模型,研究病毒感染细胞后细胞蛋白质组学差异变化,探讨H7N9流感病毒感染人类致病机制.将感染复数(MOI)为0.001的H7N9、H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h后提取细胞总蛋白进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定差异蛋白.质谱共鉴定出H7N9和H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h上调或下调的差异蛋白分别为11、12、33个.对差异蛋白进行功能分析发现与H1N1pdm09感染组相比,(纤)丝状肌动蛋白成帽蛋白α1(F-actin-capping protein subunit alpha-1,CapZ-α1)、鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)、Poly (rC)-binding protein 1(PCBP1)、真核翻译起始因子5A-1(Eukaryotic translation initiation factor 5A-1,eIF5A)在H7N9感染A549细胞后表达量的下调加速了致细胞病变效应.血小板活化因子乙酰水解酶Ⅰb亚基β(Platelet-activating factor acetylhydrolaseIb subunit beta,PAFAH1B2)在H7N9感染A549细胞后期表达量显著降低可能与该病毒感染患者的临床症状相关.
关键词： H7N9流感病毒 A549细胞 荧光双向差异凝胶电泳 蛋白质组学 -
河北省人感染H7N9流感病例的流行病学调查与病原学分析
目的 调查河北省首例人感染H7N9流感的病毒来源并进行病原学分析,为防控人感染HTN9流感提供科学依据. 方法 采集与患者流行病学相关联的标本,提取RNA,应用Real-time RT-PCR方法检测病毒RNA;一步法RT-PCR扩增HTN9流感病毒基因HA和NA片段,测序并拼接基因组序列.下载GenBank公布的H7N9流感病毒的HA和NA序列,采用Mega 6.0软件对拼接序列进行序列比对并构建进化树,分析分离株H7N9与标本中检出的H7N9病毒序列同源性. 结果 河北省首例人感染H7N9流感病例于2013年7月20日确诊,患者发病前曾暴露与活禽市场.采集22份流行病相关标本,其中1份污水标本经检测甲型流感与H7亚型和N9亚型阳性,其余21份标本阴性.通过基因扩增测序,对其血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示来源于病例和污水标本病毒的血凝素基因核苷酸和氨基酸同源性为100％,血凝素基因发生G186V和Q226L突变;神经氨酸酶基因核苷酸同源性为99.9％,氨基酸同源性为100％,未发生R292K突变.进化树显示二者亲缘关系近. 结论 河北省首例H7N9流感病例的感染可能与活禽市场环境暴露有关.该病例感染的病毒HA和NA基因与国内流行的H7N9流感病毒高度同源.
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六株不同地区分离的H7N9流感病毒假病毒制备与生物学特性研究
目的 选择不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株,制备各代表株的假病毒,为H7N9疫苗对不同地区毒株的免疫保护效果评价奠定基础.方法 通过对29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的氨基酸序列分析,获得6株不同地区H7N9亚型流感病毒代表株病毒;采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,以HA与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)作为包膜质粒,包装获得6株带有荧光素酶报告基因的假病毒;通过电镜负染、Western blot检测、感染MDCK后的荧光素酶读值和血凝试验等了解6株假病毒的生物学特性,通过血清交叉中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况.结果 筛选获得6株不同地区分离的H7N9流感病毒代表株并制备了相应的假病毒颗粒,电镜下可观察到典型的流感病毒形态,Western blot可检测到HA、NA和P24的表达;滴度测定结果显示6株假病毒对MDCK细胞的感染力为104～ 105TCID50/50μl,血凝活性可达64～ 512;SH1上海株H7N9 HA疫苗免疫血清针对6株流感假病毒100TCID50剂量的中和效力不同,提示6株假病毒可用于疫苗的交叉免疫效果评价.结论 成功获得6株H7N9不同地区代表株流感假病毒,为疫苗的免疫效果评价奠定了基础.
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深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA-UTR基因分子特征分析
目的 了解深圳市H5N6、H7 N9流感病毒HA基因非翻译区(Untranslated region,UTR)的分子特征.方法 使用MEGA7.0、DNAStar7.1.0等生物信息学分析软件对全球及深圳H5N6、H7N9流感病毒HA基因的UTR进行核苷酸序列同源性分析及基因多态性分析.结果 3株2014-2015年深圳市H5N6病毒与其他H5NX病毒株比较,HA-3'UTR核苷酸同源性为77.4％～100％,H5N6-HA-3'UTR未见明显突变位点;HA-5'UTR核苷酸同源性为91.7％ ～ 100％,H5N6-HA-5'UTR第24、31位发生突变.11株2013-2014年深圳市H7N9病毒与其他H7NX病毒株比较,HA-5'UTR核苷酸同源性为81.2％ ～100％,H7N9-HA-5'UTR在第2～6、9、10、12及15 ～ 17位发生多位点突变.结论 深圳市人感染H5N6及H7N9病毒HA的UTR保守区高度同源性及其可变区具有基因多态性.
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季节性流感疫苗免疫血清与H7N9禽流感病毒交叉反应
目的 分析接种季节性流感疫苗人群是否具有对新发H7N9流感病毒具有交叉保护,并反向检测了雪貂产生H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒的免疫反应.方法 利用血凝抑制试验和微量中和实验检测疫苗免疫后人群转阳血清对A/Anhui/1(H7N9)病毒中和作用及雪貂H7N9抗血清与A/California/07/2009(H1N1)、A/PR/8/34(H1 N1)、A/Brisbane/59/2007(H1 N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Shenzhen/406 H/2006(H5N1)和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)等不同亚型病毒的中和作用.结果 季节性流感疫苗受众者转阳血清与H7N9病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性,雪貂H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性.结论 季节性流感疫苗接种人群不具有对新发H7N9流感病毒交叉保护,并且反向验证了H7N9病毒抗血清与H1/H3/H5亚型流感病毒亦无交叉免疫反应.
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H7 N9流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位预测及其与HLA－Ⅱ类等位基因的相关性分析
目的：分析H7N9流感病毒的HA、NA蛋白的抗原表位；预测H7N9流感病毒相关的HLA－Ⅱ类等位基因及易感人群。方法：软件分析HA、NA的同源性、B细胞表位、T细胞表位以及与HA、NA结合力强的HLA－Ⅱ类等位基因；并根据该等位基因在亚洲不同地域的基因频率，预测H7N9的易感人群。结果：H7N9流感病毒株之间氨基酸序列相对保守；HA具有10个B细胞表位和15个T细胞表位；NA有12个B细胞表位和9个T细胞表位；HLA等位基因DRB1*0701与HA、NA具有强结合力，在新疆、哈尔滨、山东、辽宁、北京、石家庄、天津等多个中国北方地区人群中的基因频率较高，高于广东、云南、台湾地区、日本和韩国。结论：预测了HA、NA的抗原性表位，为H7 N9流感病毒的疫苗研究提供了理论基础；HLA－DRB1*0701与H7 N9流感病毒高度相关；H7 N9流感病毒在新疆、哈尔滨、山东、辽宁、北京、石家庄、天津地区更易传播。
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1例人感染H7N9禽流感的药学监护
目的 探讨对H7N9流感病毒可能有效的治疗方案以及药学监护思路.方法 对临床药师参与的1例人感染H7N9禽流感的药物治疗全过程进行药学监护,并总结分析.结果 临床药师对患者的抗病毒、抗细菌和抗炎治疗过程开展药学监护,并对期间出现的肝功能损害进行分析和探讨.结论 神经氨酸酶抑制剂可能有效,静注人免疫球蛋白的作用不可忽视,糖皮质激素的使用仍有争议.临床药师必须培养临床思维能力,药学监护以药物疗效为首要出发点,密切关注用药细节,警惕药物不良反应.
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H7N9流感病毒在4种细胞中培养情况的研究
目的 了解H7N9流感病毒在不同细胞中增殖的感染动力学差异.方法 将H7N9流感病毒分别接种于鸡成纤维细胞(DF-1)、狗肾细胞(MDCK)、入支气管上皮细胞(BEAS-2B)、人肺腺癌细胞(A549),观察病毒在各细胞阿增殖后细胞病变效应(CPE)、血凝实验滴度及50％组织培养细胞感染剂量.结果 H7N9流感病毒在A549细胞中培养36 h可达到血凝效价高,同时可见明显CPE,在DF-1及MDCK细胞中培养72 h后血凝效价达到高;在BEAS-2B细胞中增殖不明显,培养液对豚鼠血无明显凝集,且培养超过96 h尚无明显CPE.DF-1细胞、MDCK细胞、A549细胞对病毒的TCID50实验结果分别为10-434、10-513、10-3.84.结论 本实验使用的H7N9流感病毒不能有效感染BEAS-2B细胞并在其中增殖,但是可以在DF-1、MDCK及A549细胞中有效增殖.增殖能力以MDCK细胞强,DF-1细胞略弱,A549细胞次之.A549细胞对病毒的吸附能力较强,可快速达到增殖的高峰.
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奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦对人 H7 N9流感病毒神经氨酸酶的抑制作用
H7 N9流感病毒属于甲型流感病毒，是一种新亚型流感病毒，2013年3月首次在人类中检测出［1-2］。目前尚未有明显证据表明该病毒可以在人与人之间传播［3］，但H7N9病毒之间的遗传变化表明其病毒较易传播给人类，并且和SARS一样可导致严重的呼吸道症状及死亡［4］。目前较常用的抗流感病毒药物主要有奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦，它们可以通过抑制神经氨酸酶（ neuraminidase ， NA）来抑制流感病毒的繁殖。 NA是一种流感病毒糖蛋白，能催化水解唾液酸末端的N-乙酰基神经氨酸与邻近寡糖D-半乳糖或是D-氨基半乳糖之间的α（2，6）或α（2，3）糖苷键，使成熟的病毒颗粒终脱离宿主细胞，感染新的上皮细胞，造成流感病毒在患者体内的扩散。虽然甲型流感病毒NA活性中心的结构在流感病毒中是较为保守的，但流感病毒基因易重组突变， NA活性位点上氨基酸残基的改变有可能使病毒对 NA 抑制剂产生明显抗药性［5-6］。因此，对NA药物抑制特性的研究有助于对人感染H7 N9流感病毒的防控工作。作者利用同源建模和分子对接方法，通过对药物分子与H7 N9 NA结合能的比较，分析药物分子对NA的抑制作用。
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传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选
目的 用分子对接方法从传统中药数据库(TCM Database@Taiwan)中筛选H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂.方法 流感病毒中神经氨酸酶作为一个已经被证明的抗流感药物靶点,从蛋白晶体结果数据库(Protein Data Bank,PDB)中提取晶体结构文件,对其三维结构活性部位进行分析,采用对接软件AutoDockVina与数据库中药物小分子进行高通量分子对接.结果 得到3个亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦(Zanamivir)的天然小分子化舍物,并确定了它们的中草药来源.结论 该结果可促进从传统中药中提取、设计以及实验合成新的抗H7N9流感病毒药物.
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深圳市H5N6、H7N9流感病毒NA?UTR序列特征
目的 分析深圳市H5N6、H7N9流感病毒神经氨酸酶(NA)基因非翻译区(UTR)的分子特性,为进一步探究NA基因与流感病毒转录复制及包装之间的关系奠定理论基础.方法 使用MEGA 7.0、DNAstar7.1.0等生物信息分析软件对全球和深圳H5N6、H7N9流感病毒NA的UTR进行核苷酸序列同源性分析及基因多态性分析.结果 2014-2015年深圳市H5N6病毒与其他HXN6病毒株比较,NA?3′端核苷酸同源性为95.1％～100.0％,H5N6?NA 3′?UTR高度保守;5′端UTR核苷酸同源性为89.7％～100.0％,H5N6?NA 5′?UTR主要在第23、27、29及33位发生突变.8株2013-2014年深圳市H7N9病毒与其他HXN9流感病毒株比较,NA?5′端UTR核苷酸同源性为93.3％～100.0％,其在第4、6及23位发生突变.结论 深圳市人感染H5N6及H7N9病毒NA?UTR的保守区具有高度同源性,其可变区具有基因多态性.
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甲型H7N9流感裂解疫苗制备及免疫保护效果的评价
目的 构建、拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株并制备甲型H7N9流感裂解疫苗,动物实验评价甲型H7N9流感裂解疫苗的免疫原性及免疫保护性效果.方法 采用反向遗传学技术将A/Anhui/1/2013(H7N9)疫苗株的HA、NA基因和A/PuertoRico/8/34(PR8)毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重配,转染细胞后筛选拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株,制备rgPR8-H7N9流感裂解疫苗抗原.腹腔注射免疫Balb/c小鼠,检测血清IgG、IgG1、IgG2a、HI效价,进一步用野生株攻毒,评价rgPR8-H7N9流感裂解疫苗的免疫保护效果.结果 成功拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9.制备的重配甲型H7N9流感裂解疫苗对小鼠产生较高的HI抗体效价.IgG13gG2a亚型检测结果表明小鼠体内以诱导体液免疫为主.攻毒实验显示甲型H7N9流感裂解疫苗能够有效降低肺部的病毒载量,肺组织病变显著减轻、体质量下降后趋于稳定,疫苗剂量达到15 μg即可全部存活.A/Anhui/1/2013(H7N9)野生株流感病毒攻毒,甲型H7N9流感裂解疫苗能够达到保护小鼠效果.结论 成功拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9,制备的甲型H7N9流感裂解疫苗具有较好的免疫原性及免疫保护性,为H7N9流感裂解疫苗的研发及进入临床研究提供了实验依据.
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H7N9流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及抗血清的制备
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统表达H7N9流感病毒血凝素(HA),以获得的重组血凝素(rHA1)蛋白免疫家兔制备抗rHA1血清,以用于单向免疫扩散(SRID)法检测H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量.方法:构建含H7N9 HA1基因的重组杆状病毒,转染Sf9细胞表达rHA1蛋白.用rHA1蛋白免疫家兔获得抗rHA1血清.通过血凝抑制(HI)法和SRID法检测抗血清的HI效价、特异性和线性范围.结果:rHA1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中成功实现分泌表达,经纯化后纯度≥90％.不同剂量的rHA1蛋白免疫家兔后获得抗rHA1血清,HI效价分别为1 280和5 120.SRID试验中可与H7N9抗原国际参考品反应并产生沉淀环,10μg· mL-1到40μg· mL-1抗原浓度范围内沉淀环直径与抗原浓度线性正相关,R2大于0.99,与H1N1、H3N2和B型流感病毒无交叉反应.用该免疫血清和H7N9抗血清国际参考品分别检测H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量,两者无显著性差异.结论:在大流感发生时,昆虫杆状病毒表达系统表达的rHA1蛋白可以用于制备SRID试验用免疫血清,以用于H7N9流感病毒裂解疫苗HA含量测定.
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芜湖市H7N9禽流感病毒外环境监测报告
H7N9型禽流感此前只发现禽类之间流行传播,一般不传染给人.但是2013年3月底在上海和安徽两地率先发现H7N9传播于人的案例,而且致病力极强,很快就发展为重症肺炎继而呼吸衰竭而死亡,此病毒在随后两个月内感染人群从华东地区扩散到全国11个省份,至2013年5月31号,全国已确诊131人,39人死亡,78人痊愈,给人类生命造成很大的破坏力[1].
