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黄芪多糖小檗碱下调IR-INS-1细胞miR-126-3p改善胰岛素抵抗
目的:研究黄芪多糖小檗碱(APBBR)调控miR-126-3p改善胰岛素抵抗INS-1细胞(IR-INS-1)的作用机制.方法:高糖诱导INS-1细胞建立胰岛素抵抗模型,放射免疫法检测黄芪多糖(AP)、小檗碱(BBR)以及APBBR干预后IR-INS-1细胞胰岛素含量;利用生物信息学方法分析miR-126-3p的潜在靶基因;RT-PCR测定各组细胞miR-126-3p靶基因IRSl mRNA水平;miR-126-3p模拟物miR-126-3p mimic和抑制剂miR-126-3p miR-inhibitor转染IR-INS-1细胞后,用RT-PCR与Western blot方法检测靶基因IRS mRNA及其靶蛋白表达水平.结果:AP组和BBR组的基础胰岛素分泌量(BIS)与模型(model)组比较无显著性差异;AP和BBR的葡萄糖刺激胰岛素分泌量(GSIS)与model组比较均有显著性差异(P＜0.05);APBBR组BIS值和GSIS值与model组比较均有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01).生物信息学方法分析结果显示IRS1为miR-126-3p潜在靶基因.RT-PCR检测结果表明,model组IRS1表达量显著低于control组(P＜0.01);AP组、BBR组及APBBR组IRS1表达量均显著高于model组(P＜0.05,P＜0.01).转染miR-126-3p mimics后,IRS1水平显著降低(P＜0.01);转染miR-126-3p inhibtor后,IRS1水平未明显降低;APBBR对转染miR-126-3p mimics的IR-INS-1细胞IRS1水平的降低有显著抑制作用.Western blot结果表明,control组的IRS1蛋白表达显著高于model组和IR negative control(IR-NC)组;126M+APBBR和126I+APBBR组的IRS1蛋白表达均显著高于model组和IR-NC组.结论:APBBR能显著促进IR-INS-1细胞的胰岛素分泌;miR-126-3p过表达能促使INS-1细胞胰岛素抵抗,APBBR可能通过下调IR-INS-1细胞miR-126-3p的表达从而增加IRS1 mRNA水平及其蛋白的表达,改善胰岛素抵抗.
关键词： 黄芪多糖小檗碱 胰岛素抵抗 INS-1细胞 miR-126-3p IRS1 -
小檗碱调控IR-HepG2细胞miR-29a-3p及胰岛素受体信号通路的作用机制研究
目的:探讨小檗碱(BBR)对胰岛素抵抗的HepG2细胞(IR-HepG2)中miR-29a-3p和胰岛素受体信号通路的调控机制.方法:建立胰岛素(100nm)诱导的IR-HepG2模型.生物信息学算法预测miR-29a-3p靶基因.通过RT-PCR检测miR-29a-3p和靶基因的mRNA表达.构建荧光素酶报告质粒,分析荧光素酶活性.将miR-29a-3p模拟物和抑制剂通过lipofectamine2000转染进IR-HepG2细胞.免疫印迹法检测胰岛素受体信号通路的各基因蛋白表达.结果:生物信息学提示IRS1是miR-29a-3p的靶基因.与对照组比较,模型组miR-29a-3p表达显著升高(P＜0.05),IRS1 mRNA表达水平显著降低(P＜0.01);BBR组抑制了这种变化(P＜0.05,P＜0.01).与阴性对照(NC)组比较,miR-29a-3p模拟物可显著抑制与IRS1 3'-UTR融合的荧光素酶报告基因的活性(P＜0.01).WB结果显示,miR-29a-3p下调IRS1蛋白表达,而miR-29a-3p则促进IRS1蛋白的表达.miR-29a-3p模拟物转染组IRS1mRNA表达下调,miR-29a-3p抑制剂转染组表达相反.BBR能够上调转染miR-29a-3p模拟物或抑制剂的IR-HepG2细胞中的IRS1 mRNA表达.在IR-HepG2细胞模型中,转染miR-29a-3p模拟物组的IRS1,pIRS1ser307、Akt、pAktser473和PDK1的蛋白表达均显著降低(P＜0.01),转染miR-29a-3p抑制剂后这些蛋白表达显著增加(P＜0.01).BBR治疗后,上述蛋白表达均显著增加.结论:miR-29a-3p在IR-HepG2细胞中能调控胰岛素受体信号传导通路,BBR能下调或维持miR-29a-3p水平,增加IRS1 mRNA和蛋白表达,调节胰岛素受体信号通路蛋白的表达.
关键词： 小檗碱 miRNA miR-29a-3p IRS1 胰岛素受体信号通路 -
利用 CRISPR／Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Ir s1）基因
目的：为研究胰岛素受体底物1（Irs1）基因与代谢病之间的关系，我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因，为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子，设计CRISPR/Cas9作用靶点，构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中，实现靶基因敲除。用T7 EN1实验初步检测靶基因的修饰情况，再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠，突变效率为83％。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。
关键词： IRS1 基因敲除 大鼠 CRISPR/Cas9 -
降糖宁胶囊对HepG2细胞糖代谢作用及其作用机制的研究
目的 观察降糖宁胶囊(人参、山药、石膏、知母等)对HepG2细胞糖代谢的影响,并探讨其降糖机制.方法 体外培养人肝癌HepG2细胞,MTT法检测降糖宁对细胞活力的影响;HE染色法观察降糖宁对细胞形态的影响;采用葡萄糖氧化酶法检测降糖宁对细胞糖消耗的影响;Western-blot检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及人胰岛素受体底物(IRS1)表达量.结果 降糖宁胶囊对HepG2细胞的活力和形态无明显影响,可明显促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗,能促进AMPKβ1/2、IRS1蛋白表达量.结论 降糖宁胶囊的降糖机制可能涉及对胰岛素受体信号通路及AMPK信号通路的影响.
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miR-145通过IGF1R与IRS1逆转胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性
目的:研究miR-145对胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP顺铂耐药的影响.方法:应用QRT-PCR检测miR-145在胃癌组织、细胞中的表达水平;MTT法和细胞克隆形成实验检测细胞活性与增殖能力;荧光素酶实验验证miR-145的靶基因;Westem blot、免疫组化和免疫荧光实验检测相关蛋白表达;流式细胞术检测耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响.结果:miR-145在胃癌组织、各种胃癌细胞株中呈低表达;在胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP中,miR-145呈低表达,IGF1R与IRS1呈高表达;上调miR-145增强SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶报告实验证实IGF1R与IRS1为miR-145的靶基因;上调miR-145显著降低靶蛋白表达,抑制SGC7901/DDP细胞增殖,促进顺铂诱导的凋亡.结论:上调miR-145通过靶向IGF1R与IRS1逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性.
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miR-29a调控IRS1促进肝门部胆管癌细胞增殖的机制研究
目的 检测miR-29a在肝门部胆管癌(hilar cholangiocarcinoma,HCCA)中的表达情况,探讨其在HCCA发生、发展中的作用.方法 收集30对HCCA组织及癌旁正常组织标本,实时荧光定量PCR法检测miR-29a表达;利用生物信息学软件预测其靶基因,并进一步采用双荧光素酶报告基因法和分子生物学实验进行验证;选取HCCA细胞株FRH0201,采用CCK-8法和流式细胞仪分别检测miR-29a/IRS1对HCCA细胞增殖及周期的影响.结果 与癌旁正常组织相比,HCCA组织中miR-29a表达明显下调(P<0.05);在肿瘤细胞株FRH0201中上调miR-29a表达后可抑制肿瘤细胞增殖,引起G0/G1期阻滞,而上调IRS1表达可有效逆转这一现象.结论 HCCA中miR-29a显著低表达,并可能通过靶向调控IRS1引起HCCA细胞异常增殖和周期阻滞.
