首页 > 文献资料
-
芪冬活血饮药物血清对脂多糖刺激下人肺微血管内皮细胞E-selectin和IP-1表达的影响
目的:研究芪冬活血饮药物血清对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)表达E-selectin和IP-10的影响.方法:将细胞随机分为5组,空白组,LPS组,正常大鼠血清+LPS组,5％药物血清+LPS组,10％药物血清+LPS组,用不同浓度的药物血清培养HPMEC 4h后,再加入lμg/mL LPS刺激HPMEC,用RT-PCR方法检测E-selectin和IP-10的mRNA表达,ELISA法检测细胞上清液中E-selectin和IP-10蛋白水平.结果:LPS刺激HPMEC细胞后E-selectin和IP-10的表达和分泌显著高于空白对照(P＜0.01),而芪冬活血饮药物血清则能降低该类细胞因子的表达和释放(P＜0.05).结论:芪冬活血饮药物血清能明显抑制HPMEC的活化,降低E-selectin和IP-10的释放,减轻炎性反应损伤.
-
山姜素对肺微血管内皮细胞损伤保护机制
目的 研究山姜素对急性人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)损伤的保护机制.方法 应用不同浓度的LPS(0.01、0.1、1.0、10 mg/L)作用于HPMECs,确定造模佳浓度.应用山姜素(40、80、160、320 mg/L)干预HPMECs损伤模型,另选择正常HPMECs为对照组,每组3个重复样本,观察各组HPMECs存活率,检测细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、TNF-α、水通道蛋白-1(APQ-1)蛋白及mRNA表达.结果 与对照组比较,模型组ICAM-1及TNF-α蛋白表达升高,AQP-1蛋白及mRNA表达降低(P＜0.05).与模型组比较,80、160 mg/L山姜素组细胞存活率升高,ICAM-1及TN F-α蛋白表达降低,AQP-1蛋白及mRNA表达升高(P ＜0.05,P＜0.01).结论 山姜素通过下调ICAM-1、TNF-α蛋白表达并上调APQ-1蛋白及mR-NA表达,从而对急性HPMECs损伤起保护作用.
-
血管紧张素-Ⅱ活化肺微血管内皮细胞核因子-κB的研究
目的 探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子-κB(NF-κB)的活性的影响,以及经典途径在Ang Ⅱ介导的NF-κB活化过程中的作用.方法 本实验分为:Ang Ⅱ组:10-6 mol/L AngⅡ分别刺激HPMEC 0、0.5、1、2、4 h;氯沙坦组:10-6mol/L氯沙坦(AngⅡ 1型受体阻滞剂)预先处理HPMEC 1 h,再予相同10-6mol/L AngⅡ刺激细胞2 h,提取胞浆蛋白和胞核蛋白.凝胶电泳迁移率分析实验(EMSA)观察细胞中NF-κB的DNA结合活性.Western印迹检测细胞浆中抑制因子κBα(IκBα)的含量.结果 AngⅡ刺激HPMEC 0.5 h后细胞中NF-κB活性明显上升(144.5±16.1),在2h达到峰值(270.1±27.2),4 h(215.1±17.8)较2 h有所下降,但仍高于0 h水平,以上各时间点与AngⅡ刺激细胞0 h(100.0±25.1)相比,差异有统计学意义(P＜0.05).与Ang Ⅱ刺激HPMEC 0 h IκBα含量(44.4%±2.1%)相比,0.5 h后IκBα含量即开始明显下降(38.9%±3.6%,P＜0.05),2 h后IκBα含量下降为明显(32.6%±2.3%,P＜0.05),4 h细胞中IκBα含量较2 h有所上升,但仍然明显低于ArgⅡ刺激0 h细胞中IκBα的含量(40.1%±4.7%,P＜0.05).氯沙坦组NF-κB活性(115.4±10.7)和IκBα含量(43.6%±3.7%)与AngⅡ组0 h相比无明显差异.氯沙坦组中NF-κB活性明显低于AngⅡ组2 h,氯沙坦组中iκBα的含量亦明显高于AngⅡ组2 h.结论 AugⅡ能通过AT1介导HPMEC中NF-κB活化.经典途径参与了AagⅡ诱导的HPMEC中NF-κB活化过程.
-
Slit2/Robo4信号通路在输血相关急性肺损伤体外模型中的表达及作用
目的 探讨Slit2/Robo4信号通路在输血相关急性肺损伤(TRALI)体外模型中的表达及作用.方法 采用两次打击多形核中性粒细胞(PMNs)介导的人肺微血管内皮细胞(HMVECs)损伤模型作为TRALI体外模型,培养0、0.5、1、2、4、6 h后,采用Western-blotting法检测Robo4和血管内皮细胞钙粘连蛋白(VE-cadherin)表达,反转录酶PCR(RT-PCR)检测Robo4和Slit2信使RNA(mRNA)表达,体外内皮细胞通透性实验测定HMVECs通透性.加入不同浓度Slit2-N(0、0.5、1、4、10、20 μg/L)与HMVECs一起温孵24 h后,检测HMVECs完整性和通透性.结果在TRALI体外模型中,Robo4和Slit2 mRNA的表达在各时间点的比较,差异均有统计学意义(F=12.880、11.060,P均<0.001);两者在2 h(0.72 ± 0.04、0.78 ± 0.05)、4 h(0.49 ± 0.04、0.49 ± 0.06)和6 h(0.34 ± 0.03、0.43 ± 0.11)均显著低于0 h(1.29 ± 0.06、1.40 ± 0.09),差异均有统计学意义(P均<0.05).Robo4蛋白表达在各时间点的比较,差异有统计学意义(F=11.560,P<0.001);其在2、4和6 h(0.99 ± 0.04、0.66 ± 0.03、0.45 ± 0.04)均显著低于0 h(1.44 ± 0.04),差异均有统计学意义(P均<0.05).同时发现,VE-cadherin蛋白表达在各时间点的比较,差异也有统计学意义(F=9.667,P<0.001);与0 h(1.46 ± 0.09)比较,VE-cadherin的表达在2、4和6 h(0.91 ± 0.08、0.78 ± 0.05、0.50 ± 0.04)也均有减少,差异均有统计学意义(P均<0.05).体外内皮细胞渗透性试验提示, HMVECs 通透性在各时间点的比较,差异有统计学意义(F = 21.940,P < 0.001);与0 h(1.42 ± 0.16)比较,HMVECs通透性在2、4、6 h(4.00 ± 0.35、5.70 ± 1.71、10.02 ± 2.24)均有增加,差异均有统计学意义(P均<0.05).加入外源性Slit2-N后,VE-cadherin蛋白表达的比较,差异有统计学意义(F=13.220,P<0.001);与0 μg/L Slit2-N组(0.41 ± 0.08)相比,VE-cadherin在4、10、20 μg/L Slit2-N组表达(1.19 ± 0.35、1.49 ± 0.13、2.12 ± 0.21)均有增加,差异均有统计学意义(P均<0.05).体外内皮细胞渗透性实验提示,HMVECs通透性比较,差异有统计学意义(F=19.430, P<0.001);与0 μg/L Slit2-N组(10.0 ± 2.2)相比,HMVECs通透性在4、10、20 μg/L Slit2-N组(4.2 ± 1.1、2.1 ± 0.7、1.8 ± 0.8)均有降低,差异均有统计学意义(P均<0.05).结论 Slit2/Robo4信号通路可能参与TRALI的病理生理过程;使用外源性Slit2-N能调节TRALI体外模型中HMVECs的完整性和通透性,为治疗TRALI提供新的思路.
-
P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导人肺微血管内皮细胞凋亡中的作用
目的：探讨P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导人肺微血管内皮细胞凋亡中的作用。方法将人肺微血管内皮细胞株进行复苏及传代培养，分为空白对照组、低氧组（低氧6 h、12 h、24 h）、肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激组（用10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的TNF-α进行刺激）、模型组（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml联合刺激）及通路阻断剂组（加入通路阻断剂SB203580进行干预）。Western-blot法分析各组细胞中P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）表达，流式细胞术分析各组细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活力，流式细胞术和TUNEL法联合检测细胞凋亡。结果与空白对照组相比，模型组p-P38MAPK表达升高（P＜0.05）。与低氧组（24 h）、TNF-α刺激组（100 ng/ml）相比，模型组（低氧24 h+TNF-α100ng/ml联合刺激）细胞活力均下降（P均＜0.01）；与模型组相比，通路阻断剂组细胞Caspase-3活力下降（P＜0.01）。与模型组相比，通路阻断剂组细胞凋亡率及凋亡指数均下降（P＜0.01）。结论 P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导的人肺微血管内皮细胞中具有促凋亡作用，P38MAPK 通路阻断剂对低氧及炎症联合刺激损伤的人肺微血管内皮细胞具有保护作用。
-
ANGPTL4对LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨ANGPTL4对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)损伤的保护作用.方法 以体外培养的HPMVECs作为实验对象,将细胞随机分为四组:正常对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、ANGPTL4表达组(A组)和ANGPTL4表达+LPS诱导组(A+L组).各处理组细胞分别培养12、24、48、72 h后采用CCK-8法观察细胞增殖;细胞孵育12 h后,采用荧光定量PCR和Wester-blot检测ANGPTL4表达水平,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的蛋白含量.结果 与C组相比,L组和A组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P＜0.01);与L组相比,A+L组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P＜0.01),LPS刺激可以抑制细胞增殖,而经过pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后这种抑制作用又被削弱了;高表达ANGPTL4抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的生成.结论 ANGPTL4可以减弱LPS抑制HPMVECs细胞增殖的作用,降低细胞中TNF-α,IL-1β和MCP-1等炎症因子的生成,这些效应可能是ANGPTL4保护肺微血管内皮细胞的作用机制之一.
-
半夏多糖对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨3种半夏(姜半夏、清半夏和法半夏)多糖(PSPR)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(hPMEC)炎症损伤的保护作用.方法 以水提醇沉法提取PSPR;体外培养的hPMEC同时加入LPS 1 mg·L-1+PSPR 100和400 mg·L-1孵育24 h.CCK-8法测定细胞存活率,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素1β(IL-1β),IL-6和IL-8释放,用Western蛋白质印迹法检测细胞IL-8和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达,实时定量PCR技术分析IL-8和ICAM-1 mRNA水平.结果 与溶剂对照组相比,LPS 1 mg·L-1损伤组细胞存活率显著降低(P<0.01);与LPS 1 mg·L-1损伤组相比,3种PSPR 100和400 mg·L-1能有效缓解LPS诱导的细胞存活率下降(P<0.01),抑制LPS诱导的TNF-α,IL-1β和IL-6释放(P<0.01),抑制LPS诱导的IL-8和ICAM-1蛋白表达增加(P<0.01)及IL-8和ICAM-1 mRNA水平增加(P<0.01).结论 3种PSPR对LPS诱导的hPMEC炎症损伤有一定的保护作用,其机制可能与抑制TNF-α,IL-1β和IL-6等促炎因子的释放有关;PSPR还可抑制IL-8和ICAM-1的表达,有助于缓解IL-8和ICAM-1引起的中性粒细胞趋化作用.
-
N-乙酰半胱氨酸对肺微血管内皮细胞核因子κB活性影响的体外研究
目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子κB(NF-κB)结合活性和环氧合酶-2(COX-2)表达的影响机制.方法 体外培养HPMEC细胞株,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用,分别采用NAC(1 mmol/L)处理1 h,肿瘤坏死因子α(TNF-α)(100 ng/mL)处理1 h,NAC+TNF-α联合处理.凝胶电泳移动抑制实验检测HPMEC NF-κB的结合活性;免疫蛋白质印迹检测相应的HPMEC胞质内NF-κB抑制蛋白(IκB-α)的表达;免疫细胞化学观察HPMEC NF-κB表达的核内转移;激光共聚焦检测NAC对HPMEC中COX-2表达的影响.结果 NAC对HPMEC的增殖活化有明显抑制作用,NAC+TNF-α联合处理组吸光度值明显低于TNF-α处理组,差异均有统计学意义(均P < 0.05).TNF-α刺激后具有诱导HPMEC NF-κB结合活性,且IκB-α表达明显减弱,NAC处理组IκB-α表达高于TNF-α处理组,差异有高度统计学意义(P < 0.01).TNF-α处理1 h后,HPMEC NF-κB的主要表达从细胞质转移至细胞核内;NAC预处理后联合TNF-α刺激,HPMEC NF-κB表达主要位于细胞质,出现核内转移极少.HPMEC经TNF-α处理后细胞内COX-2表达明显高于NAC+TNF-α联合处理组以及正常对照组,差异均有统计学意义(均P < 0.05);而NAC+TNF-α联合处理组与正常对照组比较,差异无统计学意义(P > 0.05).结论 NAC 可抑制HPMEC增殖活化;NAC可抑制HPMEC NF-κB结合活性、减少核内转移发生和COX-2的表达.
-
脂多糖刺激下的人肺微血管内皮细胞血管紧张素Ⅱ受体1放射受体分析法的建立
目的 建立一种脂多糖(LPS)刺激下人肺微血管内皮细胞(HPMEC)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(ATR1)与其配体AngⅡ结合的放射配体结合分析法(RLBA).方法 体外培养的HPMEC接种于24孔培养板,当细胞达到80%～90%融合,饥饿24 h后用浓度为100 ng/ml的LPS刺激8 h,用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 fmol 8个不同剂量的放射性配体125I-AngⅡ(TL表示其放射性)在板孔中与ATR1结合 (存在或不存在5 μg AngⅡ),然后γ计数仪计数,测定ATR1的总结合 (TB) 与非特异性结合 (NSB),TL减去TB得游离放射配体 (F),TB减去NSB得ATR1的特异性结合 (B).由TB与TL作图得ATR1饱和曲线;由B/F与B作图得出Scatchart曲线.结果 随放射性配体125I-AngⅡ加入量的增加,NSB也相应逐渐增加,且由直线相关与回归分析得到NSB与加入125I-AngⅡ剂量呈直线关系(r2=0.9929);Scatchart作图得B/F与B也呈直线关系,其相关系数r2=0.9514.HPMEC上仅存在单一亲和力的AngⅡ受体,反应亲和力的Kd值为109 pmol/5×105细胞,从Scatchart曲线与X轴截距得到ATR1的大结合位点Bmax为29 pmol/5×105细胞;ATR1饱和曲线分为两段,前段斜率较大,随125I-AngⅡ加入量的增加TB增加明显;后端曲线较为平坦,TB随125I-AngⅡ的增加变化不明显,125I-AngⅡ在1600 pmol/5×105细胞与2000 pmol/5×105细胞之间TB的增加与NBS增加基本相当,能使ATR1饱和的125I-AngⅡ剂量为1600 pmol/5×105细胞.结论 本实验建立的RLBA方法能得到ATR1的Kd与Bmax两个基本参数,可用于LPS刺激下HPMEC的ATR1功能研究.
关键词： 人肺微血管内皮细胞 血管紧张素Ⅱ 1型受体 脂多糖 放射配体结合分析法 -
膜突蛋白及其抗体对人肺微血管内皮细胞损伤机制的研究
目的 通过抗膜突蛋白单克隆抗体(MmAb)介导人肺微血管内皮细胞(HPMEC)损伤模型,探讨膜突蛋白及其抗体在肺血管损伤和肺动脉高压(PAH)形成过程中的作用.方法 以磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组,肿瘤坏死因子(TNF)-α、MmAb及TN-α+MmAb作为实验组分别作用于HPMEC,在不同时相应用免疫印记法检测细胞上清液中膜突蛋白表达量,流式细胞仪对细胞表面膜突蛋白抗原表达量和细胞凋亡进行检测,同时应用激光共聚焦显微镜和电子显微镜评判HPMEC形态和功能的变化,用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学处理.结果 ①TNF-α作用后HPMEC上清液中和细胞膜表面的膜突蛋白表达量均较对照组显著增加(P<0.01);②TNF-α+MmAb组致HPMEC凋亡率显著高于TNF-α组(31.4%与14.1%,P<0.01),亦显著高于MmAb组(31.4%与3.89%,P<0.01);③TNF-α+MmAb共同作用在激光共聚焦显微镜下可见HPMEC骨架结构F-actin功能丧失、逐渐出现核浓聚和细胞凋亡,在电镜下可见HPMEC微绒毛明显减少,近乎消失.结论 HPMEC有膜突蛋白表达,在TNF-α作用下细胞外可检测到膜突蛋白,MmAb可以对HPMEC造成损伤,主要表现为对数生长期的细胞出现骨架蛋白结构改变和早期凋亡.
-
应用激光共聚焦扫描显微镜技术检测缺氧人肺微血管内皮细胞内钙离子浓度动态变化
目的:探讨应用激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)技术检测缺氧状态的人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)内钙离子(Ca<'2+>)浓度动态变化的价值.方法:HPMVEC常规培养,按观察时间点不同分为5个缺氧培养Ca(1h hyp组、2h hyp组、4h hyp组、6h hyp组和8h hyp组)以及1个对照组(Oh con组)共6个组,每组设8个复孔,应用LSCM技术测定缺氧后HPMVEC内Ca<'2+>浓度水平及随时间推移的变化.结果:LSCM技术显示HPMVEC内Ca<'2+>矿的荧光强度1h hyp组与Oh con组比较、2h hyp组与1h hyp组比较、4h hyp组与2h hyp组比较、6h hyp组与4h hyp组比较、8h hyp组与6h hyp组比较有显著差异(P<0.05).线性回归分析结果显示Ca<'2+>荧光强度与缺氧时间成正相关(r=0.969,P<0.01).结论:HPMVEC内Ca<'2+>浓度随缺氧时间增长而增高;LSCM在动态检测缺氧状态下HPMVEC内的Ca<'2+>浓度变化中具有明显优势.
关键词： 激光扫描共聚焦显微镜 缺氧 人肺微血管内皮细胞 钙离子浓度 -
人重组C5a对微血管内皮细胞表达组织因子的影响
目的 研究人重组C5a (human-recombinant C5a,rh-C5a)对人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMECs)表达组织因子(tissue factor,TF)的影响.方法 用不同浓度(100、200、300 μg/L)的rh-C5a刺激HPMECs 8 h和同一浓度(200 μg/L)的rh-C5a刺激HPMECs 4、8、12 h.采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测TF基因和蛋白表达情况.选取刺激浓度为200 μg/L,作用时间为8 h组进行C5a反义肽R4干预,相同的方法检测TF基因和蛋白表达并用免疫组织化学方法定性检测NF-κB p65变化. 结果正常的HPMECs基本不表达TF,rh-C5a刺激后,TF mRNA和蛋白开始表达,刺激的12 h内呈现出时效和量效关系(P<0.05).用C5a反义肽R4干预后,TF mRNA水平降至未干预组的68%(P<0.05),蛋白表达也有下降.免疫组织化学示p65在胞浆内明显增加并有部分入核.结论 在刺激的12 h内,C5a对HPMECs表达TF 存在时间-浓度的依赖关系,机制可能是C5a与其受体结合后,通过细胞信号转导途径活化NF-κB,从而调节基因和蛋白的表达.
-
血管紧张素Ⅱ对高糖状态下脂多糖诱导的人肺微血管内皮细胞通透性和细胞骨架蛋白的影响
目的:探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对高糖状态下脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)通透性和其骨架蛋白纤维型肌动蛋白(F-actin)的影响.方法:将正常培养的HPMVEC分为空白对照组、高糖组、高糖加LPS组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ受体拮抗剂组5组.建立单层细胞培养模型,流式细胞仪检测F-actin含量.激光共聚焦显微镜下观察HPMVEC骨架.ELISA测定培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度.结果:(1)细胞通透性高糖加LPS组较空白对照组、高糖组显著增加(P＜0.01),Ang Ⅱ组较高糖加LPS组显著增高(P＜0.05),Ang Ⅱ受体拮抗剂组较Ang Ⅱ组显著降低(P＜0.05).(2)F-actin含量高糖加LPS组较空白对照组、高糖组明显减少,Ang Ⅱ组较高糖加LPS组明显减少(P＜0.01),Ang Ⅱ受体拮抗剂组较Ang Ⅱ组显著增加(P＜0.05).(3)镜下高糖加LPS组整个细胞墙面细胞骨架排列紊乱无序,F-actin可见断裂,较空白对照组的排列有序、分布均匀有明显的改变;Ang Ⅱ组细胞完全破坏,细胞骨架不可见,细胞分界不清;AngⅡ受体拮抗剂组细胞骨架尚清晰.(4) TNF-α浓度高糖加LPS组较空白对照组、高糖组显著增加(P＜0.01),Ang Ⅱ组较高糖加LPS组显著增加,Ang Ⅱ受体拮抗剂组较Ang Ⅱ组显著降低(P＜0.01).结论:Ang Ⅱ引起高糖状态下LPS诱导的HPMVEC通透性增加,促进细胞骨架蛋白F-actin解聚,加快细胞骨架损坏,Ang Ⅱ受体拮抗剂可拮抗HPMVEC通透性的改变.
关键词： 高糖状态 人肺微血管内皮细胞 血管紧张素Ⅱ 脂多糖 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 -
血管紧张素Ⅱ对人肺微血管内皮细胞核因子-κB的活化作用
目的 探讨不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在不同时间点对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子-κB(NF-κB)的活化作用.方法 采用原代培养的HPMEC,分别以浓度为10-8、10-7、10-6、10 mol·L-1的AngⅡ刺激HPMEC0、0.5、1、2、4 h,用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)观察NF-κB对DNA的结合活性.结果 各浓度组AngⅡ均能活化HPMEC中NF-κB;与0 h比较,AngⅡ10-8 mol·L-1组在4 h表现出明显的NF-κB活化作用(P＜0.05),AngⅡ10-7 mol·L-1组在1 h开始活化NF-κB(P＜0.05),随后各时间点的效应逐渐增强;AngⅡ10-6 mol·L-1组在1 h开始活化NF-κB(与0 h比较,P＜0.05),2 h时达到高峰(与1 h比较,P＜0.05),4 h活化水平下降(与2 h比较,P＜0.05);AngⅡ10-5 mol·L-1组在0.5 h即明显活化NF-κB(与0 h比较,P＜0.05),随后各时间点NF-κB活化效应逐渐减弱.结论 AngⅡ刺激HPMEC后能引起NF-κB活性增加,这可能是AngⅡ促炎作用的重要环节.
-
丹酚酸A对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞线粒体自噬和细胞损伤的影响
目的:探讨丹酚酸A(Sal A)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)线粒体自噬和细胞损伤的影响.方法:采用终浓度为10 μg/mL LPS构建细胞损伤模型,并将实验分为对照组、Sal A组、LPS组、LPS+Sal A组.采用噻唑蓝染色法分析细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞内活性氧(ROS)含量和线粒体膜电位水平,蛋白免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)-II/I、Beclin1、PTEN介导的假定激酶蛋白1(PINK1)和Parkin蛋白相对表达量.结果:10 μg/mL LPS呈时间依赖性抑制HPMVECs的增殖;LPS+Sal A组细胞相对存活率高于LPS组,低于对照组(P<0.05).LPS组ROS含量(283.96%±10.88%)增高,膜电位水平(38.25%±5.69%)降低,与对照组(100%)相比差异有统计学意义(P<0.05);LPS+Sal A组ROS含量(138.76%±11.82%)低于LPS组,线粒体膜电位水平(76.56%±6.22%)高于LPS组(P<0.05).LPS组细胞LC3-II/I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表达量较对照组增高(P<0.05),LPS+Sal A组LC3-II/I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白相对表达量低于LPS组(P<0.05);LPS组线粒体PINK1和Parkin蛋白表达量与对照组比较增高(P<0.05),LPS+Sal A组明显低于LPS组(P<0.05).结论:Sal A减轻LPS诱导的HPMVECs细胞细胞损伤作用,其可能机制与其降低细胞内ROS,稳定线粒体膜电位,抑制线粒体自噬有关.
-
重组人白细胞介素-10对缺氧条件下人肺微血管内皮细胞凋亡的影响
目的 研究低氧条件下,重组人IL-10 (rhIL-10)对人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3( Caspase-3)活性的影响.方法 常规培养HPMVEC细胞株,分为5组:正常对照组(常规培养)；缺氧对照组(50 mL·L-1CO2,950mL· L-1 N2)；缺氧培养并加入rhIL-10,并按rhIL-10剂量(10×103ng·L-1、50x103 ng·L-1、100x 103ng·L-1)分为rhIb-10低剂量干预组、rhIL-10中剂量干预组、rhIL-10高剂量干预组.培养4h、12 h、24 h、48 h离心收集细胞,化学比色法检测细胞核内Caspase3活性,24h核荧光染色并在荧光显微镜下观察荧光强度,并进行统计学分析.结果 4h,凋亡蛋白Caspase-3相对活性各组间无明显差异(P＞0.05);12h,缺氧对照组,rhIL-10低、中剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa＜0.05),rhIL-10高剂量干预组与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较显著降低(Pa＜0.05);24 h,缺氧对照组、rhIL-10各剂量干预组与E常对照组比较显著升高(pa＜0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa＜0.05)；48 h,缺氧对照组和rhIL-10低剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa＜0.05),低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa＞0.05)；缺氧凋亡峰值见于24h.24h,各组行凋亡细胞核Hoechst荧光染色,缺氧对照组和rhIL-10低、中、高剂量干预组灰度值与正常对照组比较均显著升高(Pa＜0.05)；rhIL-10低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较显著降低(P.＜0.05).结论 缺氧可促进HPMVEC凋亡,rhIL-10可一定程度地抑制HPMVEC凋亡,这些变化可能与急性缺氧性各器官疾病密切相关.
-
N-钙黏蛋白抗体对毛霉菌丝感染人肺微血管内皮细胞组织因子和血管性血友病因子表达水平的影响
目的:观察毛霉菌丝对人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)分泌凝血因子的影响及N-钙黏蛋白抗体的干预作用.方法:取增殖期HPMVEC,分为毛霉菌丝感染模型组(毛霉菌丝组,用1×10CFU毛霉菌丝与HPMVEC在37℃、5% CO2 饱和湿度下共培养12h)、人N-钙黏蛋白单克隆抗体干预组[N-钙黏蛋白抗体组,在HPMVEC与毛霉菌丝共培养前,先用该抗体(1mg/ml)与HPMVEC室温作用1h,之后按毛霉菌丝组操作]和空白对照组(用无菌去离子水代替毛霉菌丝悬液,且不行N-钙黏蛋白抗体作用,按毛霉菌丝组方法平行实验).分别于0h、1h、2h、6h、12h收集各组培养上清液,采用ELISA检测其组织因子(TF)和血管性血友病因子(vWF)水平.结果:组内比较,毛霉菌丝组TF和vWF水平随培养时间增加而升高(均P<0.05或P<0.01);组间比较,毛霉菌丝组各时相TF和vWF水平均较空白对照组升高(P<0.05或P<0.01),而N-钙黏蛋白抗体组各时相TF和vWF水平均较毛霉菌丝组显著降低(P<0.05或P<0.01).结论:毛霉菌丝感染HPMVEC所致TF、vWF水平升高可被N-钙黏蛋白单克隆抗体有效下调,或可用于防治由毛霉菌丝感染引起的血管内皮细胞损伤和血栓形成.
-
盐酸戊乙奎醚对内毒素刺激的肺微血管内皮细胞的作用及对β-抑制蛋白-2的影响
目的:探讨在内毒素(LPS)作用下盐酸戊乙奎醚(PHCD)对肺微血管内皮细胞的作用及β-抑制蛋白-2(β-arrestin-2)表达的影响.方法:培养人肺微血管内皮细胞,用随机数字表法将其分为4组:正常对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、PHCD+LPS组(PL组)及PHCD对照组(P组).P组和PL组加入终浓度为2μg/ml的PH-CD,L组及PL组加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS,PL组于加入PHCD后60 min再加入LPS,C组加入同等体积的培养基.加入LPS 60 min后,测细胞LDH水平、VCAM-1、VE-cadherin表达及β-arrestin-2的表达.结果:与C组比较,L组细胞LDH水平、VCAM-1表达升高,VE-cadherin和β-arrestin-2表达降低;与L组比较,PL组细胞LDH水平、VCAM1表达降低,而VE-cadherin和β-arrestin-2表达增加.结论:盐酸戊乙奎醚预处理,可以通过上调β-arrestin-2的表达,减轻LPS引起的肺微血管内皮细胞损伤.
-
低氧联合TNF-α对人肺微血管内皮细胞氧化应激及凋亡的影响
目的 探讨低氧联合肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)氧化应激及凋亡的影响.方法 低氧6、12、24 h及10、20、50、100 ng/mL TNF-α分别处理HPMVECs,使用MTT比色法检测各组的细胞活性;选用佳的低氧时间及TNF-α剂量作为联合干预组,检测各组上清液的丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力及细胞凋亡率.结果 低氧及TNF-α联合干预组的MDA含量、LDH活力及细胞凋亡率明显高于单独作用组(均P＜0.05),而SOD活力低于单独作用组(均P＜0.05);且低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组的细胞凋亡率高(P＜0.05).结论 低氧联合TNF-α作用于HPMVECs后,细胞的氧化应激及凋亡率明显增加.
-
脂多糖对人肺微血管内皮细胞骨架及TNF-α和IFN-γ表达的影响
目的 探讨脂多糖 (LPS) 直接诱导人肺微血管内皮细胞 (HPMVEC)后细胞骨架的改变,肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)mRNA的表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ的表达水平的改变.方法 HPMVEC生长至80 %以上融合时,加入LPS 以 500 ng/mL浓度刺激细胞分别至 0、4、6、8 h,经鬼笔环肽染色后采用激光共聚焦显微镜观察HPMVEC细胞骨架的变化.至预定时相点离心收集培养液上清液,利用实时荧光定量RT-PCR法检测TNF-α、IFN-γ mRNA的表达,采用 ELISA方法测定细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ的表达水平,并进行统计学分析.结果 LPS 刺激培养后,8 h组细胞开始出现细胞骨架改变;4 h组TNF-α、IFN-γ mRNA表达与0 h组差异无统计学意义(P>0.05),6 h组TNF-α、IFN-γ mRNA表达高于0 h组(P<0.05),8 h组TNF-α、IFN-γ表达高于0 h组(P<0.05);4 h 组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平与0 h组比较差异无统计学意义(P>0.05),6 h 组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平高于0 h组(P<0.05),8 h组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平高于0 h组(P<0.05).结论 细菌致病因子LPS能直接刺激HPMVEC使细胞结构发生改变,同时影响细胞因子的分泌,使促炎因子TNF-α和IFN-γ分泌升高,参与肺损伤.这可能是LPS发挥其毒性作用诱发急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的一个重要途径.
