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Nested PCR在检测角膜和结膜组织中HBV DNA的应用
摘要:摘要:目的:建立角膜、结膜组织中乙型肝炎病原体检测的快速可靠的方法.方法:采用巢式聚合酶链反应技术(Nested PCR)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性者的血清24例、结膜12例、角膜4例,以及HBsAg阴性者的血清30例.结果:24例HBsAg阳性者的血清HBV DNA均阳性,检出率100%,12例HBsAg阳性者的结膜中11例阳性,检出率91.7%,4例HBsAg阳性者的角膜中3例检出HBV DNA.30例HBsAg阴性者的血清中,检出2例(HBV DNA)阳性.结论:Nested-PCR是一种检测角、结膜组织中HBV-DNA的快速可靠的方法.
关键词： 巢式聚合酶链反应 角膜 结膜 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 -
实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在289例白血病融合基因检测中的比较
目的 比较实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)与巢式聚合酶链反应(nPCR)在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中的结果.方法 分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析.结果 46例初诊慢性粒细胞白血病(CML)患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7％和93.5％(P=0.997)；69例完全缓解CML患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为78.4％和58.1％(P＜0.05).32例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中,RT-PCR与nPCR检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8％和90.6％(P=0.996)；114例完全缓解APL患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为12.3％和7.0％(P＜0.05).12例初诊急性粒细胞白血病M2(ANLL-M2)患者中,RT-PCR与nPCR检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0％和50.0％(P=1.0)；16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为50.0％和12.5％(P＜0.05).结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据.
关键词： 白血病 融合基因 实时定量聚合酶链反应 巢式聚合酶链反应 -
40例川崎病与微小病毒B19关系
目的:进一步探讨微小病毒B19 (HPVB19)与小儿川崎病(KD)发病的关系.方法:应用巢式PCR法和ELISA法对40例川崎病患儿(观察组)及30例随机挑选门诊健康体检儿童(对照组)进行B19-DNA检测和B19 VP2 IgM检测.对观察组KD患儿中HPV B19-DNA检测阳性的与阴性的两组中应用心脏彩超检测冠状动脉内径值变化进行比较.结果:观察组B19-DNA阳性检出率为27.5% (11/40),对照组B19-DNA检测均为阴性,两组比较差异有统计学意义(P<0.01).观察组B19 VP21g M阳性检出率为27.5% (11/40),对照组均阴性,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)o Bl9-DNA和B19 VP2 IgM-致率为100.0%.40例观察组中HPV B19-DNA检测阳性的与阴性的两组中,心脏彩超冠状动脉内径值变化差异有统计学意义(P<0.01).40例川崎病患儿在性别、年龄、常见临床表现、预后等方面无差别.结论:HPV B19与小儿川崎病发病有关,HPV B19可能是小儿川崎病病原之一;HPV B19与冠状动脉扩张或瘤形成可能相关,HPV B19感染所致冠状动脉扩张程度较重.
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61例不完全性川崎病与微小病毒B19感染
目的 探讨不完全性川崎病与微小病毒B19(HPVB19)感染相关性.方法 应用巢式PCR法对166例典型川崎病(KD)(观察组)及61例不完全性川崎病(对照组)进行B19-DNA检测.对观察组与对照组HPVB19-DNA检测阳性的与阴性的两组中应用心脏彩超检测冠状动脉内径值进行比较.结果 观察组(典型川崎病)B19-DNA阳性检出率为27.4%(45/166),对照组(不完全性川崎病)B19-DNA阳性检出率检为47.5%(29/61),两组比较有显著差别(P＜0.01).观察组(典型川崎病)与对照组(不完全性川崎病)HPVB19-DNA检测阳性的两组中,心脏彩超冠状动脉内径值比较有显著差异(P＜0.01).结论 微小病毒B19 与不完全性川崎病(KD) 相关,并且微小病毒B19感染造成冠状动脉病变比较严重.
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肾移植术后受者人巨细胞病毒巢式PCR检测
目的 探讨巢式PCR检测肾移植术后受者人巨细胞病毒(HCMV) DNA的方法,并与ELISA法进行比较.方法 针对HCMV AD169株IEA基因设计两对巢式PCR引物,对50例肾移植术后受体血、尿标本进行HCMV DNA 检测.分离血清作ELISA 检测IgG、IgM.结果 血液巢式PCR 阳性率56%,尿液阳性率46%;ELISA 法阳性率:IgG 82%,IgM 28%,IgG+IgM 28%.两种方法的阳性率进行统计学分析,P＜0.05,存在统计学差异.结论 巢式PCR是一种敏感、快速诊断HCMV感染的方法,灵敏度及特异性均高于传统ELISA法,并能弥补ELISA 的假阴性.不仅为临床HCMV疾病的诊断与治疗,同时也为选择普遍性预防抑或症状发生前的预先治疗提供可靠的实验室依据.
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40例川崎病患儿微小病毒B19感染的近期分析
目的 进一步探讨微小病毒B19(HPVB19)与小儿川崎病(KD)发病的关系.方法 应用巢式PCR法和ELISA法对40例川崎病(KD)患儿(观察组)及30例随机挑选本院门诊健康体检儿童(对照组)进行B19-DNA检测和B19 VP2 IgM检测.对观察组KD患儿中HPVB19-DNA检测阳性的与阴性的两组中应用心脏彩超检测冠状动脉内径值变化进行比较.结果 观察组B19-DNA阳性检出率为27.5%(11/40),对照组B19-DNA检测均为阴性,两组比较有显著差别(P＜0.01).观察组B19 VP2 IgM阳性检出率为27.5%(11/40),对照组均阴性,两组比较有显著差别(P＜0.01).B19 DNA和B19 VF2 IgM-致率为100%.40例观察组中HPVB19-DNA检测阳性与阴性两组中,心脏彩超冠状动脉内径值变化有显著差异(P＜0.01).40例川崎病患儿在性别、年龄、常见临床表现、预后等方面无差别.结论 HPVB19与小儿川崎病(KD)发病的有关,HPVBl9可能是小儿川崎病(KD)病原之一;HPVB19与冠状动脉扩张或瘤形成可能相关,HPVB19感染所致冠状动脉扩张程度较重.
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非甲～庚型慢性肝炎患者中TTV检测及临床意义
研究TTV在非甲～庚型慢性肝炎患者中的感染状况及临床意义.采用巢式PCR法对44例非甲～庚型慢性肝炎患者血清中TTVDNA进行检测,并与肝组织病理学结果比较.44例中,TTVDNA阳性率为27.3%(12/44),TTV阳性组肝组织损伤程度记分高于TTV阴性组,但差异无显著性(P＞0.05).TTV感染可能是导致非甲～庚型慢性肝炎肝组织病理损害的原因之一.
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Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定
目的:获得人Flt3配体(FL)cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白.方法:提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达.用镍凝胶亲和层析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性.结果:经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致.构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol·L-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25 000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25 000处可见特异性着色带.结论:构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白.
关键词： 配体 原核表达 巢式聚合酶链反应 遗传载体/分离与提纯 -
犬贾第虫巢式PCR检测方法的建立
目的 建立犬贾第虫巢式PCR检测方法并进行验证.方法 根据犬贾第虫Rnase P基因序列设计两对特异性引物,通过优化Mg2+浓度和退火温度建立巢式PCR检测方法,并进行灵敏度和特异性验证.用优化的巢式PCR方法检测60份犬临床粪样.结果 建立的巢式PCR方法的佳Mg2+浓度为3.0 mmol/L;佳退火温度为53℃;对犬贾第虫的低检测量可达1个虫体DNA/ml;对柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、犬心丝虫等寄生虫基因组DNA的扩增结果均为阴性;60份犬临床粪样贾第虫的检出率为61.7％.结论 建立的巢式PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于犬贾第虫感染的临床检测.
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检测低拷贝数HBVDNA含量的临床研究
目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度.方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1× 101-1.0× 103拷贝数/毫升的低拷贝数标本.然后,三家不同公司的试剂(方法B、方法C、方法D)对这些样本进行复核.另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本.随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人.结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4)；101-102 (21,17,18,22)；102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7).同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果.巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1～3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上.结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性.巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法.该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息.
关键词： 低拷贝数HBV DNA 实时荧光定量PCR 巢式聚合酶链反应 -
巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究
目的 用巢式聚合酶链反应(PCR)对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测.方法 根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增.对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测.结果 不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带.68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见.结论 巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测.
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孕妇血浆中游离胎儿DNA在产前诊断中的初步应用
目的 探讨孕妇血浆中游离胎儿DNA在非创伤性产前诊断中的可行性.方法 用柱分离法提取46例孕妇血浆中胎儿DNA,用巢式聚合酶链反应(PCR)技术扩增其胎儿SRY基因,并引入内参照基因ATL1特异序列.结果 28例孕男胎的孕妇血浆中有26例经巢式PCR扩增出SRY基因,18例孕女胎的孕妇血浆中有17例经巢式PCR只扩增出ATL1基因.灵敏度和特异度分别为92.9％( 26/28)和94.4％( 17/18),总符合率为93.5％(43/46).结论 应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断灵敏度和特异度较高,是一种非创伤性产前诊断方法,具有广泛的临床应用前景.
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用多重PCR快速检测登革病毒并分型
目的建立一种多重聚合酶链反应(PCR)方法,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型.方法采用4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT-PCR)反应,继用4对(5种)型特异引物在单管内进行巢式PCR,依据扩增产物的片段大小进行分型.结果采用多重PCR,扩增出482、119、290及392 bp的特异片段,分别代表登革病毒1～4型.结论该方法快速、敏感、特异,有一定的推广应用价值.
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巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用
目的评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率.方法对2000-2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西林耐药情况后,用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测.结果检出74株氨苄西林耐药Hi.nested-PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致,74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib,约占2.7%.结论nested-PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充.3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中,Hib的比率处于相对较低的水平.
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病毒性心肌炎患儿微小病毒B19感染的研究
目的探讨病毒性心肌炎患儿微小病毒B19(HPV B19)感染的状况及其相关性.方法应用巢式聚合酶链反应法对60例病毒性心肌炎患儿(观察组)及30例健康体检儿童(对照组)血浆中微小病毒B19-DNA进行检测,并对观察组中HPV B19-DNA检测阳性与阴性两组中血CK、CK-MB及心功能指标进行比较.结果观察组B19-DNA检测阳性率为26.7%(16/60例),对照组B19-DNA检测均为阴性,两组比较差异有显著性(P＜0.01).观察组中HPV B19-DNA检测阳性与阴性的两组中血CK、CK-MB值差异无显著性(P＞0.05).心功能指标LVSF比较差异有显著性(P＜0.01),SV比较差异亦有显著性(P＜0.05).结论小儿病毒性心肌炎与HPV B19感染有关,HPV B19可能是小儿病毒性心肌炎主要病原之一;HPV B19感染所致小儿病毒性心肌炎的心功能改变中左室功能受累程度较重.
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型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义
目的应用型特异性引物巢式PCR检测HBV基因型并初步了解山东地区HBV基因型的分布状况.方法随机选择山东地区HBV DNA阳性患者共178例,其中无症状携带者(ASC)53例,慢性活动性肝炎(CH)(包括轻、中、重度)87例,肝硬化(LC)38例,先通过外引物进行第一轮PCR,然后,将6对型特异性引物分到两个反应体系(MixA和MixB)中分别对第一轮扩增产物进行第二轮PCR,根据阳性结果判断出样本的基因型.结果C基因型85例(47.8%),B基因型63例(35.4%),B+C混合基因型30例(16.8%).C基因型在活动性肝病(CH及LC)中占优势,而ASC组则是以B基因型为主,差异有显著性(P＜0.01).C基因组中HBeAg阳性率、HBV DNA定量及ALT水平均较B基因组为高(P＜0.001或P＜0.005),而抗HBe阳性率则在B基因型组显著升高(P＜0.005).结论山东地区存在C、B及B+C混合基因型,并以C基因型为主.型特异性引物巢式PCR敏感性高,特异性强,可以快捷准确地检测HBV基因型.
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一种快速检测乳腺癌患者外周血高表达基因FAM83A的巢式PCR法
目的 建立一种快速简便检测乳腺癌患者外周血中FAM83A基因的巢式PCR法.方法 设计退火温度分别为72℃和60℃的内、外侧两对引物,在一个PCR反应中,同时加入0.2 μmol/L外侧引物和20μmol/L内侧引物,使两轮PCR扩增反应一步完成.分别用建立的巢式PCR法与传统巢式PCR法检测35例乳腺癌患者和8例健康人外周血样本,比较其特异性；将乳腺癌细胞株MCF-7系列稀释后分析两法的灵敏度.结果 建立的巢式PCR法与传统巢式PCR法在43例标本中均检出16例阳性,并都能检测出10-6稀释的MCF-7细胞,两法特异性和灵敏度相同.本法步骤简便,所需时间缩短了24 min.结论 建立的巢式PCR法敏感、特异,且快速、简便,适用于临床快速检测.
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巢式-实时PCR检测梅毒初诊患者不同样本中梅毒螺旋体靶DNA
目的 探讨巢式-实时PCR(NR-PCR)检测初诊梅毒患者不同样本中梅毒螺旋体(Tp)靶DNA的可行性及应用前景.方法 以Tp polA为靶基因,用NR-PCR检测梅毒患者初诊时皮损拭子、血清、全血、脑脊液、末梢耳垂血等样本中的靶DNA,用统计软件SPSS.13分析结果.结果 NR-PCR检测Tp polA靶DNA的极限为2个Tp/ml,总体阳性率为71.7%,检测不同类样本的阳性率从高到低依次为:耳垂血92.0%>脑脊液90.2%>拭子74.3%>血清66.9%>全血64.2%.NR-PCR结果与血清学检查结果的一致性为76.0%(152/200).进一步分析显示:一期、二期梅毒拭子DNA阳性率(63.2%比87.5%)差异无统计学意义(χ2=2.62,P>0.05);血清样本中,二期梅毒DNA阳性率高于一期梅毒(χ2=3.6,P=0.06);全血样本中,二期梅毒DNA阳性率高于其他各类型梅毒;神经梅毒耳垂末梢血阳性率与脑脊液比较,P=0.06.隐性梅毒血清(RPR)滴度≥1:8组的Tp DNA阳性率高于RPR≤1:4组.结论 NR-PCR方法检测梅毒患者不同样本中Tp DNA是可行的,不同类型梅毒、不同类型样本以及其血清RPR滴度水平都影响Tp DNA阳性率.
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巢式聚合酶链反应检测烟曲霉基因
烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)是临床上重要的条件致病性真菌之一 , 造成侵袭性感染时死亡率很高。传统的诊断方法尚有不少难点，如形态学鉴定费时，抗原检测敏感性低等。我们采用基因检测路线，设计出烟曲霉特异性引物，结合巢式聚合酶链反应的方法，对烟曲霉基因检测进行了初步探讨 [1,2]。
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多重巢式聚合酶链反应在疟疾混合感染检测与分型中的应用
目的：应用能够同时检测恶性疟（ P.falciparum）、间日疟（ P.vivax）、卵形疟（ P.ovale）、三日疟（ P.malarie）及其混合感染的多重巢式PCR方法，对疑似疟疾混合感染样本进行检测，评价其在疟原虫混合感染及分型中的应用价值，旨在为疟疾流行病学调查、疟疾混合感染的确诊提供一种快速高效、特异性强、灵敏度高的实验室诊断方法，为传统的镜检法提供有效的补充。方法：根据恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的18 SSU rRNA基因序列设计5对引物（1对通用引物、4对特异性引物），以等比例混合的4种疟原虫核酸为模板，建立疟疾多重巢式PCR检测方法，并应用该法对28份疑似疟疾混合感染样本进行检测及测序验证，将其结果与镜检法比较。结果：28份疑似混合感染样本中混合感染样品数为6例，其中恶性疟和间日疟混合感染样品5例，恶性疟和卵形疟混合感染样品1例。结论：本研究建立的多重巢式PCR检测方法能够同时用于恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟及其混合感染样本的检测，在疟疾混合感染的确诊与分型上较镜检法有明显的优势和更高的应用价值。
