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中国圆田螺多糖体外抗乙肝病毒的实验研究
目的:探讨中国圆田螺多糖(PCC)体外抗乙肝病毒的生物学活性.方法:以HepG2 2.2.15细胞系为体外实验模型.MTT法检测细胞毒性,将不同安全浓度的PCC及阳性对照药物3TC作用于此细胞系,实验同时设不加药物的细胞对照,第9天收集细胞培养上清液.采用ELISA法测定各组细胞培养上清液中HBsAg,HBeAg水平,荧光探针定量PCR检测HBV-DNA含量.结果:PCC在HepG2 2.2.15细胞培养中的TCo为1g·L-1,TC50 ＞10 g·L-1,对细胞毒性较小.PCC对HepG2 2.2.15细胞HBsAg,HBeAg分泌的IC50分别为0.501,0.401 g·L-1,SI分别为＞19.96和＞24.94.PCC可以有效抑制HBsAg,HBeAg的分泌,且PCC对HBeAg的抑制效果优于HBsAg.PCC在0.1,1g·L-1(P＜0.05)对HepG2 2.2.15细胞中的HBV-DNA有明显的抑制作用.结论:中国圆田螺多糖具有一定的体外抗HBV活性,且毒性较小,具有良好的应用前景.
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乙型肝炎病毒感染模型的研究进展
HBV感染是影响人类健康的主要问题之一.HBV的生物学研究及治疗方法进展缓慢是由于缺乏合适的体内外模型.如何建立一种有效的HBV感染模型,对于探索其感染机制,寻找有效的防治方法及开展抗HBV药物的筛选都具有重要的科研及临床意义.随着医学科学的不断发展,国内外学者进行了大量的研究,建立了多种HBV感染的体内外模型,每一种模型都有其优势和弊端,本文简要综述了各种模型在HBV研究中的应用进展及相应优、缺点.
关键词： 乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒感染模型 2.2.15细胞 鸭乙型肝炎病毒 -
针对HBV S基因mRNA反义锁核酸设计及其在2.2.15细胞内的抗病毒作用
目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)S 基因翻译起始区反义锁核酸(LNA) 片段在HepG22.2.15 细胞内抗病毒效果及有效LNA 序列筛选. 方法:设计合成互补于HBV S 基因mRNA 翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA 片段及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15 细胞,采用ELISA 法和FQPCR 法分别监测24 、48 和72 h 细胞培养上清液中HBsAg 和HBV DNA 的含量;MTT 法检测LNA 对细胞代谢的影响. 结果:4条不同序列长度(10 、15 、20 及25 个碱基)的反义LNA 对HBsAg 的表达和HBV DNA 的复制均有显著性抑制作用,72h 后的抑制率分别为46.58% 、54.38% 、72.43% 、69.92% 及27.09% 、28.77% 、34.71% 、32.68%,且抑制率随时间呈增高趋势. LNA 对细胞代谢无明显影响. 结论:针对HBV S 基因mRNA 翻译起始区的反义LNA 短序列体外能显著抑制HBV 基因的表达,且抑制作用强的序列长度应在15-25 个碱基之间.
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愈肝胶囊体外抗乙型肝炎病毒的作用
目的:通过观察愈肝胶囊对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg及HBV DNA的影响,探讨在体外水平上愈肝胶囊的抗乙肝病毒作用.方法:将实验家兔(n=6)随机分为3组:正常血清组、乙肝宁颗粒组、愈肝胶囊组,分别灌服洁净生理盐水5 mL/次,乙肝宁颗粒3.4 g/(kg·d),愈肝胶囊0.7 g/(kg·d),3次/d.测定含不同浓度愈肝胶囊血清抗HBV活性情况.2.2.15细胞培养上清液HBsAg、HBeAg测定采用ELISA法,HBV DNA检测采用PCR杂交试验法.结果:作用5 d时,与乙肝宁颗粒组比较,含愈肝胶囊血清1:1组抗HBV作用优于乙肝宁颗粒组(HBsAg:53.93±1.34 vs 41.03±0.85,P＜0.05;HBeAg:55.25±1.42 vs 36.26±0.97,P＜0.01;HBV DNA:56.81±2.37 vs 43.71±0.98,P＜0.01);1:2组、1:4组、1:8组差异无显著性;1:16组则作用较乙肝宁颗粒组低.药物作用10 d时,与细胞对照组及正常血清组比较,各含愈肝胶囊血清组抗HBV作用均比较显著.与乙肝宁颗粒组比较,含愈肝胶囊血清1:1组抗HBV DNA作用优于乙肝宁颗粒组(67.23±2.79 vs 48.02±1.03,P＜0.05);1:2组和1:4组对HBeAg及HBV DNA的作用优于乙肝宁颗粒组;1:8组和1:16组对HBV DNA作用低于乙肝宁颗粒组.结论:含愈肝胶囊血清在体外细胞培养中对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg及HBV DNA均有较好的抑制作用,其抑制作用随其浓度增大而增强.
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HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果
目的:探讨针对HBV preS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系,作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBVDNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.
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壮药汗衣台体外抗乙型肝炎病毒的疗效
目的:研究汗衣台体外抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的疗效.方法:不同浓度汗衣台与体外培养的2.2.15细胞共同孵育,以XTT方法检测其对2.2.15细胞的不良反应,以此决定汗衣台的安全浓度范围；3d更换一次含药培养液,9d后收集上清液；用ELISA法测定上清液中HBsAg和HBeAg含量,荧光定量PCR法检测上清液中HBV DNA的分泌.结果:各浓度汗衣台对HBsAg、HBeAg均有明显抑制作用,抑制率呈剂量依赖性:500-800 μg/mL汗衣台对HBsAg的抑制明显高于同浓度的拉米夫定(P=0.002-0.000)及干扰素(P=0.006-0.003),100-800μg/mL浓度汗衣台对HBeAg的抑制明显高于同浓度拉米夫定(P=0.002-0.000)及干扰素(P=0.003-0.002),差异均有显著性.各浓度汗衣台对HBV DNA抑制亦呈剂量依赖性,500-800 μg/mL浓度汗衣台短期内抑制HBVDNA分泌的疗效优于同浓度干扰素(P=0.018-0.031),但不如拉米夫定.结论:壮药汗衣台具有一定的体外抗HBV作用.
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绿原酸对抗乙肝病毒-HBsAg和HBeAg的抑制作用
目的 观察绿原酸对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用.方法 以2.2.15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定绿原酸对细胞的大无毒浓度,在大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成250、125、62.5 μg/ml,加入2.2.15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液,分别收集第4、8天的培养液,酶联免疫法测定HBsAg、HBeAg含量.结果 绿原酸对2.2.15细胞大无毒浓度为250 μg/ml.在大无毒浓度(250 μg/ml)时,两批试验对HBsAg、HBeAg均具有明显的抑制作用.第4、8天时对HBeAg的平均抑制率分别为89.45%、82.00%,对HBsAg的抑制率分别为86.54%、88.00%.结论 绿原酸对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用.
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水芹总酚酸对人肝癌2.2.15细胞周期的影响
目的 研究水芹总酚酸对人肝癌2.2.15细胞增殖抑制及细胞周期的影响.方法 用不同浓度的水芹总酚酸作用于体外培养的2.2.15细胞,采用MTT法检测水芹总酚酸对2.2.15细胞增殖抑制能力；倒置显微镜观察2.2.15细胞的形态学变化；流式细胞术检测水芹总酚酸对2.2.15细胞周期的影响.结果 水芹总酚酸对2.2.15细胞增殖具有明显的抑制作用,且具有剂量依赖性；流式细胞术检测表明水芹总酚酸作用于2.2.15细胞后,可将细胞阻滞在S期.结论 水芹总酚酸对人肝癌2.2.15细胞具有明显的抑制增殖作用,可能与阻滞细胞周期有关.
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苯丙氨酸二肽类化合物073对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响
目的 观察苯丙氨酸二肽类化合物073对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响.方法 以2.2.15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定苯丙氨酸二肽类化合物073对细胞的大无毒浓度(TC0),在大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成50、25、12.5μg·mL-1加入2.2.15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4天的培养液上清,酶联免疫法(ELISA)测定HBsAg、HBeAg含量.结果 苯丙氨酸二肽类化合物073大无毒浓度为50μg·mL-1,在大无毒浓度时对HBsAg有明显的抑制作用,第8天时的抑制率为59.3%,半数抑制浓度(IC50)为22.9μg·mL-1,治疗指数(TI)为3.1;但对HBeAg无明显抑制作用,第8天时的抑制率仅为25.5%.结论 苯丙氨酸二肽类化合物073对2.2.15细胞HBsAg有显著的抑制作用.
关键词： 苯内氨酸二肽类化合物073 2.2.15细胞 HBsAg HBeAg -
水芹总酚酸对2.2.15细胞分泌HBsAg与HBeAg的抑制作用
目的 观察水芹总酚酸对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用.方法 以2.2.15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定水芹总酚酸对细胞的大无毒浓度(TC0),在大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成500、250、125μg·mL-1加入2.2.15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4d的培养液,酶联免疫法(EHSA)测定HBsAg、HBeAg含量.结果 水芹总酚酸大无毒浓度为500μg·mL-1,在大无毒浓度时对HBsAg、HBeAg具有明显的抑制作用,第8天时的抑制率分别为59.33%和90%,半数抑制浓度(IC50)分别为484.17、379.89μg·mL-1,治疗指数(TI)分别为3.158、4.025,其中对HBeAg的抑制作用优于HBsAg.结论 水芹总酚酸对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用.
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赋肝能抗病毒作用实验研究
目的研究中药制剂赋肝能(由植物鹅绒蒌陵菜Potentilla asserina L.分离提取而得的主要活性成分)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用.方法建立以HBV转染的人肝癌细胞系(Hep G2)2.2.15细胞系为体外模型,HBV静脉感染、血清DHBV-DNA(duck hepatitis B virus-DNA)呈强阳性的北京鸭为体内模型,分别观察2.2.15细胞含药培养基中HBsAg和HBeAg及鸭血清中DHBV-DNA水平.结果体外实验中,8 d时,各剂量组赋肝能对HBsAg和HBeAg均有明显抑制作用.大剂量赋肝能对HBsAg和HBsAg有显著抑制作用(P＜0.01).体内实验观察,大剂量和中剂量赋肝能对DHBV-DNA有明显抑制作用(P＜0.05,P＜0.01),其抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性.结论赋肝能对乙型肝炎病毒具有明显抑制作用,可能成为较好的治疗乙型肝炎的临床用药.
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蛋清溶菌酶对乙肝病毒的抑制作用
目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用.方法:以2.2.15细胞为模型,以苦参碱为阳性对照药,采用细胞病变法(CPE)和酶联免疫吸附实验(ELISA)判定溶菌酶对2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达水平的抑制效果.结果:HEWL对细胞的大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)均>1 000 μg·mL-1,HEWL对2.2.15细胞HBsAg抑制作用的半数有效浓度(IC50)为(213.0±71.3) μg·mL-1,对细胞HBeAg无抑制作用.苦参碱对2.2.15细胞的TC0和TC50均>250 μg·mL-1.苦参碱对2.2.15细胞HBsAg抑制作用IC50的为(54.2±17.1) μg·mL-1,对HBeAg无抑制作用.结论:蛋清溶菌酶对2.2.15细胞的HBsAg表达有较明显的抑制作用,对其HBeAg无抑制作用.
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拉米夫定等六种药物的体外抗乙型肝炎病毒作用
目的观察拉米夫定(3TC)等6种药物对抗乙型肝炎病毒(HBV)体外药效评价及不同指标之间的关系.方法利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞,检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)及乙肝病毒DNA(HBV-DNA)的含量作为药物抗HBV效果的观察指标.结果 (1) 6种药物在一定浓度范围内对2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg抑制作用很弱或无抑制;(2)HBV-DNA定量检测拉米夫定和2′3′-二脱氧-3-氟鸟苷(FLG)对HBV DNA 水平有明显抑制作用,其半数有效剂量(IC50)分别为0.31 μmol/L,0.53 μmol/L,阿昔洛韦(ACV)和α-干扰素(α-IFN)之IC50分别为0.33 mmol/L、96.18 U/ml,膦甲酸钠( PFA)和利巴韦林(RBV)大无毒浓度无任何抑制作用.结论抑制HBsAg与HBeAg的病毒蛋白表达活性与抑制HBV DNA活性无一致相关性,以HBV DNA指标更能反映化合物的抑制作用.
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灵芝和虫草多糖对酒精性肝损伤和2.2.15细胞 分泌乙型肝炎表面抗原和e抗原的影响
目的 观察灵芝多糖和虫草多糖组成的复方制剂(LCF)对小鼠酒精性肝损伤的保护作用和对2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的影响.方法 末次给液20 min后,后4组一次性给予50％乙醇20 ml,禁食24 h后处理,在酒精性肝损伤模型中,小鼠随机分成对照组,模型组和LCF低中高剂量组,分别灌胃双蒸水和对应试液（等容量）3d,测定血清ALT和AST的活性,肝匀浆MDA、GSH和TG的含量；在2.2.15细胞模型中,LCF稀释成不同浓度加入2.2.15细胞进行培养,每3d换合同浓度药物培养液,分别收集3d、6d以及停药后3d的培养液,测定HBsAg和HBeAg的含量.结果 与模型组比较,LCF高剂量组能显著降低血清中ALT和AST的水平,低中剂量组显著升高肝匀浆中GSH含量和降低TG含量,中高剂量显著降低肝匀浆中MDA含量.LCF连续给予3d时1和2 mg·ml-1剂量组、6d时0.25、0.5、1和2 mg/ml剂量组及停LCF3 d的0.5、1.0和2.0 mg/ml剂量组分别能显著抑制HBsAg的分泌.各剂量组在各测定时间点对HBeAg均无显著影响.结论 LCF对酒精性肝损伤具有保护作用,对2.2.15细胞分泌HBsAg具有显著抑制作用.
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2.2.15细胞生长规律的探讨及在药物筛选中应用
目的探讨2.2.15细胞生长及其分泌HBsAg和HBeAg的规律以及在药物筛选中的应用.方法利用HBV的体外细胞培养系统(2.2.15细胞系)建立抗HBV药物筛选的实验技术常规,对2.2.15细胞及其分泌HBsAg和HBeAg的特性进行初步观察,并在此基础上对几种药物体外抗HBV活性进行研究.结果选择每孔接种0.1 mL浓度为3×108L-1的2.2.15细胞培养至8～12 d为细胞指数生长期,滴板后第1天上清中HBsAg和HBeAg均阳性,第12天达高峰且含量高.药物阿特福韦二吡呋酯、鞣花鞣质、无环鸟苷、α-干扰素对细胞的半数毒性浓度分别为0.67 M,0.49 g/L,0.75 g/L,＞10×108IU/L,对病毒HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别为2.79,4.47;27.22,5.44;1,1;1,1.结论2.2.15细胞抗HBV药物筛选以3×108L1/孔培养至12d作为常规方法较为合适.阿特福韦二吡呋酯、鞣花鞣质均有显著体外抗病毒作用,可以作为阳性药物对照.
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芪黄冲剂体外(2.2.15细胞)抗病毒的药效学研究
目的通过体外抗病毒实验研究芪黄冲剂在无明显细胞毒性浓度下对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响,以验证芪黄冲剂对病毒复制的影响.方法用MTT法测定芪黄冲剂在不同浓度下的细胞毒性,ELISA法检测芪黄冲剂及其拆方在不同浓度下在9～12d及第13天对共同培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响.结果芪黄冲剂1～4号在各浓度下均无明显细胞毒性,芪黄冲剂对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒有明显的抑制作用.结论芪黄冲剂和其拆方组份(1～4组份)对HBV-DNA转染肿瘤细胞株(2.2.15细胞)无明显和直接的细胞毒性作用.芪黄冲剂可抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg,具有良好的抗乙型肝炎病毒的作用.
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磺酸左氧氟沙星对细胞内HBV S区及C区HBV RNA的影响
目的研究磺酸左氧氟沙星对2.2.15细胞内HBV S区及C区的HBV RNA的影响 .方法用荧光PCR定量法分别检测细胞内HBV DNA、HBV S区及C区的HBV RNA含量;并用固相放射免疫法测细胞上清HBsAg、HBeAg的P/N值.结果 2.2.15细胞内HBV S区及C区的HBV RNA含量分别为0.4pg/ml和0.2 7pg/ml,细胞上清HBsAg及HBeAg分别为42.1和36.0.磺酸左氧氟沙星作用8天后,HBV RN A含量分别下降为0.2pg/ml和0.13pg/ml(P＜0.05),对两者的抑制率分别为50%和4 8.1%;HBsAg及HBeAg分别下降为6.0和16.2(P＜0.05),其抑制率分别为85.7%及55 .6%(P＜0.05),用药前2.2.15细胞内HBV DNA为2.97pg/ml,用药后降至0.44pg/m l(P＜0.05),抑制率为85.2%.结论磺酸左氧氟沙星抗HBV的作用可能是通过影响HBV 3.5kb及2.1kb RNA 的稳定性及翻译表达来实现.
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脱氧核酶及锁核酸核酶对2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达的抑制作用
目的:观察针对HBV前C/C区的脱氧核酶(DNAzyme)及锁核酸核酶(LNAzyme)对2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg表达的抑制作用.方法:设计合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23DNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及LNAzyme.本实验设对照组和10-23DNAzyme组、点硫代修饰的10-23DNAzyme组、LNAzyme实验组.对照组包括空白对照组、单纯脂质体对照组、单纯10-23DNAzyme对照组、无关10-23DNAzyme对照组.观察在0.16、0.64、1.28、1.60及1.92μmol·L-1浓度下及12、24、36、48、60、72、84及96 h时间段对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达的抑制效应.结果:10-23DNAzyme及LNAzyme作用于2.2.15细胞后,可明显抑制HBsAg、HBeAg的表达,且抑制率LNAzyme明显高于点硫代修饰的10-23DNAzyme,而后者又明显高于未进行任何修饰的10-23DNAzyme组.LNAzyme及点硫代修饰的10-23DNAzyme对HBsAg的高抑制率分别是(91.6±8.4)%和(78.4±2.0)%,对HBeAg的高抑制率分别是(90.1±5.2)%和(76.4±4.8)%;在给药后12 h就表现出抑制效应,48 h达高峰,LNAzymes、点硫代修饰的10-23DNAzyme有效抑制时间分别是为84及72 h.其对2.2.15细胞未见明显的细胞毒性作用.结论:10-23DNAzyme及LNAzyme对2.2.15细胞具有明显的高效阻断HBV的HBsAg、HBeAg表达的作用,且LNAzyme优于DNAzyme,是一类特异的高效的抗HBV治疗剂.
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血清药理学方法研究广西藤茶提取物对乙肝病毒的作用
目的 研究广西藤茶提取物APS在体外对乙肝病毒(HBV)的作用.方法 采用血清药理学方法,将APS含药血清作用于2.2.15细胞,收集细胞上清液,用MTT法测定细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量.结果 APS含药血清对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著抑制作用.结论 APS对2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒抗原有抑制作用.
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苷泰胶囊抗乙肝病毒的实验研究
目的 观察苷泰胶囊对乙肝病毒复制的抑制作用.方法 使用鸭乙肝炎病毒使1日龄的北京鸭感染,造模7d后给药(ig),使用斑点杂交法检验用药后(5、10 d)及停药5d后血清中的DHBV DNA含量;以转染的2.2.15细胞为模型,分别加入不同浓度的苷泰胶囊药液,分别以酶联免疫法及斑点杂交法检测培养上清液中的HbsAg,HbeAg及HBV DNA的水平.结果 (1)用药后10d和停药后3d鸭血清中的DHBV DNA水平显著低于给药前(P＜0.01,P＜0.05);(2)苷泰胶囊可以明显地抑制2.2.15细胞HbsAg、HbeAg的分泌(P＜0.01,P＜0.05),其半数抑制浓度分别为1 158.92μg /mL和1 794.14 μ g/mL;(3)苷泰胶囊明显地抑制2.2.15细胞HBV-DNA的复制,其半数抑制浓度为701.27 μg /mL.结论 实验结果表面苷泰胶囊对2.2.15细胞及鸭乙肝病毒感染的模型均具有一定抑制作用并呈剂量依赖性.
